Новый метод введения клеток с минимальной инвазией

Эксперименты на животных проводились в соответствии с этическими рекомендациями Медицинского университета Кансай для экспериментов на животных и были одобрены этическими комитетами (номер одобрения: 23-104). Все животные были выращены в постоянном цикле света и темноты в специфической среде, свободной от патогенов. Все стерилизованные хирургические инструменты, такие как ножницы, щипцы и ретракторы, были автоклавированы и тщательно высушены. 1. Приготовление шариков кардиомиоцитов новорожденной крысы Коллекция сердец новорожденных крысДля забора сердца выполните процедуру, аналогичную той, что описана в предыдущем отчете7. Неонатальных (0-2 дня после рождения) крыс Спрэга-Доули (SD) последовательно погружают в растворы повидон-йода и 70% этанола, а затем переносят их в герметичный футляр, заполненный испаренным изофлураном (концентрация должна быть более 10% v/v) для глубокой анестезии. После подтверждения потери сознания потерей двигательной активности обезглавить крысу, держась рукой за туловище со спины, а затем острыми ножницами отрезать 2-4 мм ткани от лобного центра грудной клетки до каудального и затем в ростральном направлении. Возьмитесь за кожу спины, чтобы растянуть порез и вытолкнуть сердце из грудной клетки. Разрежьте желудочки ножницами и погрузите их в фосфатно-солевой буфер (PBS) без кальция или магния (PBS(−)). Дисперсия кардиомиоцитов новорожденных крысСобранные желудочки, диспергированные в минимальном количестве буфера Ads (буфер Ads: 116 мМ NaCl, 20 мМ HEPES, 12,5 мМ2PO 4, 5,6 мМ глюкозы, 5,4 мМ KCl, 0,8 мМ MgSO4, рН 7,35) в автоклавной вогнутой стеклянной посуде на небольшие кусочки (1 мм х 1 мм) с помощью изогнутых ножниц. Перенесите измельченные ткани и микромагнитную мешалку в центрифугированную пробирку объемом 50 мл и диспергируйте ткани в отдельные клетки с 0,1% коллагеназы, 0,1% трипсина, 20 мкг/мл ДНКазы I и 50 нМ метилового эфира тетраметилродамина в буфере Ads при 37 °C, перемешивая в течение 30 мин. Отделите агрегаты и дисперсные клетки путем естественного осаждения, соберите только дисперсные клетки в пробирку и снова переварите остаточные клеточные агрегаты в той же среде для сбраживания. Продолжайте эту процедуру до тех пор, пока все клетки полностью не диссоциируют. Чтобы убедиться в полной дисперсии клеток, понаблюдайте за пробирками под микроскопом (4-кратный объектив). Соберите дисперсные клетки с помощью центрифугирования при 150 x g в течение 5 мин и диссоциируйте их в 1-2 мл буфера Ads. Флуоресцентно-активированная сортировка клеток кардиомиоцитовАнализ клеток с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) с использованием полосовых фильтров 556-601 нм для обнаружения красных флуоресцентных сигналов. Тщательно выполняют предварительную литниковую обработку для исключения дублетных фракций14. Настройки строба для устранения дублетов должны соответствовать инструкциям производителя. Установите прямое рассеяние по оси X и красный сигнал флуоресценции по оси y. Наблюдались три популяции: самая нижняя популяция, содержащая эритроциты и мертвые клетки, средняя популяция, содержащая некардиомиоциты, включая фибробласты и эндотелиальные клетки, и верхняя популяция, содержащая чистые кардиомиоциты желудочков. Приготовление красных меченых флуоресценцией шариков кардиомиоцитовСелективно сортируют кардиомиоциты и центрифугируют в течение 5 мин при 150 х г. Полностью растворите клеточные гранулы в 1 мл альфа-модифицированной минимальной эфирной среды (альфа-МЭМ), содержащей 10% термически инактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS). Измерьте концентрацию клеток с помощью гемоцитометра и разбавьте раствор клеточной суспензии до 3000 клеток/мл альфа-MEM 10% FBS. Распределите их по клеточным неадгезивным 96-луночным планшетам (100 мкл на лунку), центрифуге в течение 5 мин при 100 x g и культивируйте в течение 2-3 дней в клеточном культуральном инкубаторе с 5% CO2 при 37 °C. Перед инъекционными экспериментами забор шарика кардиомиоцитов из каждой лунки путем аспирации с питательной средой с помощью пипетки объемом 1 000 мкл и сбор их в пробирку объемом 15 мл. Покрасьте PKH26 в соответствии с инструкциями производителя по отслеживанию после приживления. 2. Препараты для медленного инъекционного метода Приготовление исходного раствора желатинаВзвесьте желатин, растворите его в буфере Ads, чтобы получить 10% раствор w/v, и автоклавируйте его. Производство устройства для введения клетокОбщая конструкция устройства: Подготовьте устройство, показанное на рисунке 1. Данная система совмещена с аппаратом охлаждения шприца и основным инъекционным аппаратом. Подготовьте основной инъекционный аппарат, описанный ниже:Для инъекции шарика кардиомиоцитов новорожденным используют иглу 29 G, длиной 50 мм, оснащенную шприцем. Подключите шприц для передачи энергии (18 г, 1 мл) вплотную друг к другу с помощью шприца для инъекций клеток (Рисунок 1). Подсоедините иглу шприца для передачи мощности к тонкой полипропиленовой трубке с низкой расширяемостью просвета. Затем подсоедините другую сторону трубки для передачи мощности к игле того же шприца (18G, 1 мл) и установите ее в шприцевой насос. Наполните два силовых шприца и пробирки водой без пузырьков воздуха.ПРИМЕЧАНИЕ: Когда один поршень шприца для передачи энергии вдавливается, давление напрямую передается другому шприцу, и поршень выступает. Настройте систему охлаждения инъекционного шприца, как описано ниже.Плотно намотайте медную трубку (внешний диаметр = 1 мм; внутренний диаметр = 0,3 мм; толщина = 0,35 мм) вокруг клеточной части шприца для инъекций клеток, оставив на обоих концах по 10 мм лишней трубы. Подсоедините медную трубку к гибкой пластиковой трубке. Далее подсоедините другие концы пластиковой трубки к внешнему насосу, заполните трубопровод охлаждающей водой и охладите воду, погрузив излишки медной трубки в колотый лед (рисунок 1).ПРИМЕЧАНИЕ: Эта система охлаждения поддерживает суспензию ячеек в цилиндре при температуре около 2 °C. 3. Разработка модели инфаркта миокарда крысы при тупой окклюзии коронарных артерий Обезболивайте самцов голых крыс с иммунодефицитом (F344/Njcl-rnu/rnu) воздухом, содержащим 3% изофлурана. Вставьте канюлю в трахею и соедините ее с респиратором. Подключите канюлю к испарителю изофлурана с контроллером, чтобы поддерживать концентрацию изофлурана 3% и, таким образом, поддерживать достаточную анестезию. Убедитесь в отсутствии реакции на болевые раздражители. Наносите ветеринарную мазь на глаза, чтобы не допустить сухости. Зафиксируйте конечности разрезанными хирургическими лентами на хирургической пластине, нагретой при температуре 40 °C. Поверните тело крысы вправо от оси тела и используйте левую подмышку в качестве операционного поля. Удалите волосы в операционном поле с помощью крема для депиляции и протрите кожу повидон-йодом. С помощью острых ножниц сделайте разрез длиной 1,5 см на коже и большой грудной мышце. Подтвердите третье межреберье и разорвите межреберные мышцы и реберную плевру с помощью микрощипцов с тупыми кончиками. Держите грудную клетку открытой, используя втягивающее устройство. Аккуратно удалите тонкий перикард щипцами. Чтобы построить модель инфаркта боковой стенки сердца, найдите положение 1 мм каудально от кончика левого предсердия, чтобы определить тупую коронарную артерию, наложите шелковый шов 7-0, зачерпните ткань шириной 2,5 мм и глубиной 2,5 мм от дорсальной до вентральной и плотно перевязайте ткань. Подтвердите успешное перевязку слабым сокращением дистальнее лигатуры. Осторожно сняв ретрактор, наложите шелковый шов 5-0 между вторым и четвертым межреберьем и закройте торакотомию. Уменьшите концентрацию изофлурана до 1%. Аккуратно зашить мышцы и кожу шелком 5-0. Уменьшите концентрацию изофлурана до 0% и подождите примерно 5 минут, пока не начнется спонтанное дыхание. Местно нанесите на разрез 2 мг/мл лидокаина в физиологическом растворе. Ввести 1 мл физиологического раствора через подкожную инъекцию. Применяйте ветеринарную мазь местно, чтобы предотвратить инфекции. Извлеките крысу из интубационной трубки и вернитесь в клетку для животных; Затем выращивайте крыс в индивидуальных клетках в течение 1 недели. Анализируют изменения функции систолического насоса сердца с помощью эхокардиографии.ПРИМЕЧАНИЕ: Сердечная функция снижается вследствие бокового инфаркта миокарда. 4. Чрескожная трансплантация клеток под контролем эхо-контроля методом медленной инъекции Предварительно нагрейте 10% желатиновый бульон при 37 °C, пока он не станет жидким. Разбавьте 10% желатиновый бульон предварительно подогретым буфером Ads, чтобы получить окончательный инъекционный 5%-ный раствор желатина (требуется 100 мкл на одно животное). Суспендировать 96 шариков кардиомиоцитов (всего: 28 800 кардиомиоцитов на животное) в 100 мкл предварительно подогретого раствора для инъекций. Суспензию, приготовленную на шаге 4.3, загружают в клеточный инъекционный шприц, избегая аспирации лишнего воздуха. Чтобы удалить пузырьки в шприце, держите его вертикально иглой вверх, постучите по шприцу и соберите все пузырьки на верхнем гребне шприца.ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этого шага наблюдайте, как шарики кардиомиоцитов постепенно оседают на резиновое уплотнение поршня. Поддерживайте вертикальное положение шприца, медленно нажимайте на поршень и выбрасывайте пузырьки и излишки клеточной суспензии до тех пор, пока в шприце не останется 20 мкл клеточной суспензии. Осторожно надавите на поршень с постоянной скоростью, чтобы шарик кардиомиоцитов оставался лежащим на резиновом уплотнении поршня. Погрузите шприц с крышкой прямо в ледяную баню на 5 минут. Поместите остывший шприц в инъекционный аппарат. Плотно зафиксируйте инъекционный шприцевой аппарат, установленный на устройстве тонкого движения, на животном предмете с помощью зажима ручной работы с регулировкой положения X-Y-Z. Устройство точного перемещения может перемещать положение иглы с помощью ползуна 20 мм в направлении X, поворота в направлении Y и изгибающихся движений в направлении Z. Обезболивайте крыс в герметичной коробке, наполненной воздухом, содержащим 3% изофлурана. Подтвердите анестезию, не реагируя на болевые раздражители. Наносите ветеринарную мазь на глаза, чтобы не допустить сухости. Зафиксируйте конечности разрезанными хирургическими лентами на эхопластине, нагретой при температуре 40 °C. Чтобы обеспечить достаточную анестезию, убедитесь, что вдыхаемый воздух содержит примерно 3% концентрации изофлурана. Удалите волосы в месте инъекции (2 см в диаметре) и грудь кремом для депиляции и протрите кожу повидон-йодом. Нанесите эхо-гель на грудную клетку и эхозонд. Поместите эхо-зонд близко к грудной клетке вдоль черепной и каудальной осей и начните получать эхокардиографию в В-режиме, следуя инструкции производителя. Введите кончик инъекционной иглы в миокард в виде спереди (рис. 2 и дополнительное видео 1). Чтобы активировать главный шприцевой насос, нажмите кнопку «Пуск » и поверните диск, чтобы настроить скорость впрыска примерно 0,02 мкл/с. Нанесите ветеринарную мазь местно вокруг места иглоукалывания, чтобы предотвратить инфекции.ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо определить соответствующий номер набора для предполагаемой скорости впрыска с помощью раствора для инъекций. После инъекции извлеките инъекционную иглу с помощью системы образцового движения. Уменьшите концентрацию изофлурана до 0% и подождите примерно 5 минут, пока животное не придет в сознание, достаточное для поддержания положения грудины. 5. Оценка сердечной функции Обезболивайте крыс в герметичной коробке, наполненной воздухом, содержащим 3% изофлурана. Подтвердите анестезию, не реагируя на болевые раздражители. Наносите ветеринарную мазь на глаза, чтобы не допустить сухости. Нанесите электризующий крем для получения ЭКГ на кончики конечностей. Зафиксируйте конечности разрезанными хирургическими лентами на эхопластине, нагретой при температуре 40 °C. Используйте систему физиологического мониторинга для определения ЭКГ и частоты сердечных сокращений в режиме реального времени. В соответствии с инструкциями производителя, сначала определите угол длинной оси с помощью эхо-изображения B-режима, показывающего вершину левого желудочка к выходному тракту, а затем поверните эхо-зонд на 90°, чтобы переключиться на вид с короткой осью. Используя только систему тонких движений от каудальной оси до ростральной оси животного, отрегулируйте вид по короткой оси на уровне папиллярной мышцы. Затем переключите режим изображения на M-режим, нажав кнопку M-режима , и запишите видео в течение 5 секунд, нажав кнопку Cine-loop . Чтобы проанализировать и рассчитать укорочение фракции с помощью программного обеспечения, нажмите кнопку «Измерить » и инструмент вертикальной линии, чтобы определить конечные систолические и конечные диастолические внутренние размеры левого желудочка. Программа автоматически рассчитывает процент сокращения фракций (FS). Уменьшите концентрацию изофлурана до 0% и подождите примерно 5 минут, пока животное не придет в сознание, достаточное для поддержания положения грудины. 6. Иммуногистохимия Зафиксируйте усыпленное тело (выполните эвтаназию, как в шаге 1.1.3) на столе с помощью разрезанных хирургических лент, удалите сердца, промойте PBS и погрузите сердце в 4% параформальдегид/PBS. Разделите сердца на три части, погрузите их в 40% сахарозу для криозащиты, поместите в компаунд с оптимальной температурой резки (OCT) и заморозьте при −80 °C. Прикрепите криосекционированные ткани (толщиной 8 мкм) к предметным стеклам, покрытым аминосиланом. После достаточной сушки с использованием ненагретого ветра, создаваемого обычным феном, погрузите предметные стекла в трис-буферный физиологический раствор, содержащий 0,2% Tween-20 (TBS-T). Погрузите их в блокирующий раствор на 30 мин при температуре 25 °C. Налейте 100 мкл первичного блокирующего раствора, содержащего антитела, на предметное стекло и инкубируйте в течение ночи при температуре 4 °C с парафиновой герметизацией, чтобы раствор антител распределился по тканям.ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация антител указана в таблице материалов. Положите предметные стекла горизонтально в самодельную коробку с высокой влажностью, используя естественный пар от влажной бумаги, чтобы предотвратить испарение. Вымойте предметные стекла три раза с помощью TBS-T. Обрабатывать вторичным антителосодержащим блокатором в течение 1 ч при 25 °C так же, как и первичным антителом. После трех промывок наблюдайте за флуоресцентными сигналами с помощью флуоресцентного микроскопа и конфокального лазерного микроскопа.ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация антител указана в таблице материалов. Статистический анализ: Для сравнения объема ячейки, как показано на рисунке 3A, выполните непарный t-критерий; Для оценки функционального восстановления сердца после введения кардиомиоцитов методом медленной инъекции, как показано на рисунке 4А, используют парный Т-критерий. В данной работе различия считались статистически значимыми при P < 0,01. Столбцы погрешности представляют собой стандартное отклонение.