Un nuovo metodo di iniezione cellulare con un'invasione minima

Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo le linee guida etiche della Kansai-Medical University per gli esperimenti sugli animali e sono stati approvati dai comitati etici (numero di approvazione: 23-104). Tutti gli animali sono stati allevati in un ciclo costante luce-buio in uno specifico ambiente privo di agenti patogeni. Tutti gli strumenti chirurgici sterilizzati, come forbici, pinze e divaricatori, sono stati sterilizzati in autoclave e asciugati accuratamente. 1. Preparazione delle palline di cardiomiociti neonatali di ratto Collezione di cuori di ratto neonatalePer il prelievo del cuore, seguire una procedura simile a quella descritta in un precedente rapporto7. Immergere i ratti neonatali (0-2 giorni dopo la nascita) Sprague-Dawley (SD) in soluzioni di iodio povidone ed etanolo al 70% in sequenza, quindi trasferirli in una custodia ermetica riempita con isoflurano vaporizzato (la concentrazione deve essere superiore al 10% v/v) per un’anestesia profonda. Dopo la conferma dell’incoscienza da parte di una perdita di attività locomotoria, decapitare il ratto mentre tiene il corpo dalla schiena con la mano, quindi tagliare 2-4 mm di tessuto dal centro frontale della gabbia toracica alla caudale e poi in direzione rostrale usando forbici affilate. Afferra la pelle posteriore per aprire il taglio e spingere fuori il cuore dalla gabbia toracica. Tagliare i ventricoli con le forbici e immergerli in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) senza calcio o magnesio (PBS(−)). Dispersione dei cardiomiociti neonatali di rattoTritare i ventricoli raccolti dispersi in una quantità minima di tampone Ads (tampone ADS: 116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 12,5 mM NaH2PO 4, 5,6 mM glucosio, 5,4 mM KCl, 0,8 mM MgSO4, pH 7,35) in una vetreria concava autoclavata in piccoli pezzi (1 mm x 1 mm) utilizzando forbici curve. Trasferire i tessuti tritati e un agitatore micromagnetico in una provetta di centrifugazione da 50 mL e disperdere i tessuti in singole cellule con collagenasi allo 0,1%, tripsina allo 0,1%, DNasi I da 20 μg/mL e estere metilico di tetrametilrodamina da 50 nM in tampone Ads a 37 °C agitando per 30 minuti. Separare gli aggregati e le cellule disperse attraverso la sedimentazione naturale, raccogliere solo le cellule disperse in una provetta e digerire nuovamente gli aggregati cellulari residui con lo stesso mezzo di digestione. Continuare questa procedura fino a quando tutte le cellule non sono completamente dissociate. Per confermare la completa dispersione delle cellule, osservare i tubi al microscopio (lente dell’obiettivo 4x). Raccogliere le cellule disperse mediante centrifugazione a 150 x g per 5 minuti e dissociarle in 1-2 mL di tampone Ads. Selezione cellulare dei cardiomiociti attivata dalla fluorescenzaAnalizza le cellule utilizzando il cell sorting attivato dalla fluorescenza (FACS) utilizzando filtri passa-banda 556-601 nm per rilevare i segnali di fluorescenza rossa. Eseguire con attenzione il pre-gating per eliminare le frazioni di doppietto14. Le impostazioni del cancello per l’eliminazione del doppietto devono essere conformi alle istruzioni del produttore. Impostare la dispersione diretta sull’asse x e il segnale di fluorescenza rossa sull’asse y. Sono state osservate tre popolazioni: una popolazione più bassa contenente eritrociti e cellule morte, una popolazione intermedia contenente non cardiomiociti, inclusi fibroblasti e cellule endoteliali, e una popolazione superiore contenente cardiomiociti ventricolari puri7. Preparazione di sfere cardiomiocitarie marcate con fluorescenza rossaOrdinare selettivamente i cardiomiociti e centrifugare per 5 minuti a 150 x g. Sciogliere completamente i pellet cellulari in 1 mL di terreno minimo essenziale alfa-modificato (alfa-MEM) contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS) inattivato dal calore. Misurare la concentrazione cellulare utilizzando un emocitometro e diluire la soluzione di sospensione cellulare a 3.000 cellule/mL con FBS alfa-MEM al 10%. Distribuirli in piastre cellulari non adesive a 96 pozzetti (100 μL per pozzetto), centrifugare per 5 minuti a 100 x g e coltura per 2-3 giorni in un incubatore per colture cellulari con il 5% di CO2 a 37 °C. Prima degli esperimenti di iniezione, prelevare una sfera di cardiomiociti da ciascun pozzetto tramite aspirazione con il terreno di coltura utilizzando una pipetta da 1.000 μL e raccoglierli in una provetta da 15 mL. Colorare con PKH26 seguendo le istruzioni del produttore per l’inseguimento dopo l’attecchimento. 2. Preparativi per il metodo dell’iniezione lenta Preparazione della soluzione madre di gelatinaPesare la gelatina, scioglierla nel tampone Ads per produrre una soluzione al 10% p/v e sterilizzarla in autoclave. Produzione di un dispositivo per l’iniezione di celluleProgettazione generale del dispositivo: Preparare l’apparecchio mostrato nella Figura 1. Questo sistema è combinato con un apparato di raffreddamento a siringa e un apparato di iniezione principale. Preparare l’apparecchiatura di iniezione principale descritta di seguito:Per un’iniezione di palline cardiomiocitarie neonatali, utilizzare un ago da 29 G, lungo 50 mm, dotato di siringa. Collegare una siringa a trasferimento di potenza (18G, 1 mL) schiena contro schiena utilizzando una siringa per iniezione cellulare (Figura 1). Collegare l’ago della siringa di trasferimento di potenza a un sottile tubo di polipropilene con bassa espandibilità del lume. Quindi, collegare l’altro lato del tubo di trasferimento dell’alimentazione all’ago della stessa siringa (18G, 1 mL) e inserirlo in una pompa a siringa. Riempire le due siringhe e i tubi di trasferimento di potenza con acqua senza bolle d’aria.NOTA: Quando uno stantuffo della siringa di trasferimento di potenza viene inserito, la pressione viene trasferita direttamente all’altra siringa e lo stantuffo sporge. Configurare il sistema di raffreddamento della siringa di iniezione come descritto di seguito.Avvolgere saldamente un tubo di rame (diametro esterno = 1 mm; diametro interno = 0,3 mm; spessore = 0,35 mm) attorno alla parte contenente la cellula della siringa per iniezione cellulare, lasciando 10 mm di tubo in eccesso ad entrambe le estremità. Collegare il tubo di rame al tubo di plastica flessibile. Inoltre, collegare le altre estremità del tubo di plastica a una pompa esterna, riempire la linea con acqua di raffreddamento e raffreddare l’acqua immergendo il tubo di rame in eccesso nel ghiaccio tritato (Figura 1).NOTA: Questo sistema di raffreddamento mantiene la soluzione di sospensione delle celle nel cilindro a circa 2 °C. 3. Sviluppo di un modello di infarto miocardico di ratto mediante occlusione coronaria ottusa Anestetizzare ratti nudi maschi immunodeficienti (F344/Njcl-rnu/rnu) con aria contenente il 3% di isoflurano. Inserire una cannula nella trachea e collegarla al respiratore. Collegare una cannula a un vaporizzatore di isoflurano con un controller per mantenere una concentrazione di isoflurano del 3% e, quindi, sostenere un’anestesia sufficiente. Confermare l’assenza di risposta agli stimoli dolorosi. Applicare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza. Fissare gli arti con nastri chirurgici tagliati su una placca chirurgica riscaldata a 40 °C. Ruota il corpo del ratto a destra dell’asse del corpo e usa l’ascella sinistra come campo chirurgico. Rimuovere i peli nel campo chirurgico utilizzando una crema depilatoria e pulire la pelle con iodio povidone. Usando delle forbici affilate, taglia un’incisione di 1,5 cm nella pelle e nel muscolo grande pettorale. Confermare il terzo spazio intercostale e strappare i muscoli intercostali e la pleura costale utilizzando micro pinze con punte smussate. Tenere il torace aperto utilizzando un divaricatore. Rimuovere delicatamente il pericardio sottile con una pinza. Per costruire un modello di infarto della parete laterale del cuore, trovare la posizione caudale di 1 mm rispetto alla punta dell’atrio sinistro per identificare l’arteria coronaria ottusa, passare una sutura di seta 7-0, raccogliere il tessuto largo 2,5 mm e profondo 2,5 mm dalla dorsale alla ventrale e legare saldamente il tessuto. Confermare l’avvenuta legatura dalla debole contrazione distale dalla legatura. Dopo aver rimosso delicatamente il divaricatore, posizionare una sutura di seta 5-0 tra il secondo e il quarto spazio intercostale e chiudere la toracotomia. Diminuire la concentrazione di isoflurano all’1%. Suturare delicatamente il muscolo e la pelle con seta 5-0. Ridurre la concentrazione di isoflurano allo 0% e attendere circa 5 minuti fino all’inizio della respirazione spontanea. Applicare localmente 2 mg/mL di lidocaina in soluzione fisiologica sull’incisione. Somministrare 1 mL di soluzione fisiologica tramite iniezione sottocutanea. Applicare l’unguento veterinario per via topica per prevenire le infezioni. Rimuovere il ratto dal tubo di intubazione e tornare nella gabbia dell’animale; Quindi, alleva i ratti in gabbie individuali per 1 settimana. Analizzare i cambiamenti nella funzione della pompa sistolica cardiaca utilizzando l’ecocardiografia.NOTA: La funzione cardiaca sarà ridotta a causa dell’infarto miocardico laterale. 4. Trapianto di cellule percutanee ecoguidate con il metodo dell’iniezione lenta Preriscaldare il brodo di gelatina al 10% a 37 °C fino a quando non diventa liquido. Diluire il brodo di gelatina al 10% con un tampone Ads preriscaldato per ottenere la soluzione finale iniettabile di gelatina al 5% p/v (sono necessari 100 μL per animale). Sospendere 96 sfere di cardiomiociti (totale: 28.800 cardiomiociti/animale) in 100 μL di soluzione iniettabile preriscaldata. Caricare la sospensione preparata al punto 4.3 nella siringa per iniezione cellulare, evitando l’aspirazione dell’aria in eccesso. Per eliminare le bolle nella siringa, tenerla verticalmente con l’ago rivolto verso l’alto, picchiettare la siringa e raccogliere eventuali bolle sulla cresta superiore della siringa.NOTA: Durante questa fase, osservare le sfere di cardiomiociti che si depositano gradualmente sulla guarnizione in gomma dello stantuffo. Mantenere la posizione verticale della siringa, spingere lentamente verso l’alto lo stantuffo ed eliminare le bolle e la soluzione di sospensione cellulare in eccesso fino a quando 20 μL della sospensione cellulare rimangono nella siringa. Spingere con cautela lo stantuffo a velocità costante in modo che la sfera cardiomiocitaria rimanga appoggiata sulla guarnizione in gomma dello stantuffo. Immergere la siringa con tappo direttamente in un bagno di ghiaccio per 5 minuti. Inserire una siringa raffreddata nell’apparecchio per l’iniezione. Fissare saldamente l’apparato della siringa per iniezione depositato su un dispositivo di movimento fine sullo stadio animale utilizzando un morsetto fatto a mano regolabile in posizione X-Y-Z. Il dispositivo di movimento fine può spostare la posizione dell’ago utilizzando il cursore da 20 mm in direzione x, l’oscillazione in direzione y e i movimenti di inchino in direzione z. Anestetizzare i ratti in una scatola sigillata riempita con aria contenente il 3% di isoflurano. Confermare l’anestesia senza rispondere agli stimoli dolorosi. Applicare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza. Fissare gli arti con nastri chirurgici tagliati su una piastra ecografica riscaldata a 40 °C. Per sostenere un’anestesia sufficiente, assicurarsi che l’aria inalata contenga una concentrazione di circa il 3% di isoflurano. Rimuovere i peli sul campo di iniezione (2 cm di diametro) e sul petto con una crema depilatoria e pulire la pelle con iodio povidone. Applicare l’eco-gel sul petto e sulla sonda eco. Posizionare la sonda ecografica vicino al torace lungo gli assi craniale e caudale e iniziare a ottenere l’ecocardiografia B-mode seguendo il manuale del produttore. Far avanzare la punta dell’ago per iniezione nel miocardio nella vista frontale (Figura 2 e video supplementare 1). Per attivare la pompa a siringa principale, premere il pulsante Start e ruotare la manopola per regolare un numero predeterminato per una velocità di iniezione di circa 0,02 μL/s. Applicare l’unguento veterinario localmente intorno alla posizione di agugliatura per prevenire le infezioni.NOTA: È necessario determinare il numero di selezione appropriato per la velocità di iniezione prevista utilizzando una soluzione di iniezione. Dopo l’iniezione, rimuovere l’ago per iniezione utilizzando un sistema di movimento esemplare. Ridurre la concentrazione di isoflurano allo 0% e attendere circa 5 minuti fino a quando l’animale riacquista una coscienza sufficiente per mantenere il decubito sternale. 5. Valutazione della funzione cardiaca Anestetizzare i ratti in una scatola sigillata riempita con aria contenente il 3% di isoflurano. Confermare l’anestesia senza rispondere agli stimoli dolorosi. Applicare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza. Applicare una crema elettrizzante per l’acquisizione dell’ECG sulle punte degli arti. Fissare gli arti con nastri chirurgici tagliati su una piastra ecografica riscaldata a 40 °C. Utilizza un sistema di monitoraggio fisiologico per rilevare l’ECG e la frequenza cardiaca in tempo reale. Secondo le istruzioni del produttore, determinare prima l’angolo dell’asse lungo utilizzando l’immagine dell’eco in modalità B che mostra l’apice ventricolare sinistro al tratto di deflusso, quindi ruotare l’ecosonda di 90° per passare alla vista dell’asse corto. Utilizzando solo il sistema di movimento fine dell’asse caudale e rostrale dello stadio animale, regolare la vista dell’asse corto a livello del muscolo papillare. Quindi, modificare la modalità immagine in modalità M premendo il pulsante della modalità M e registrare un video per 5 secondi premendo il pulsante Cine-loop . Per analizzare e calcolare l’accorciamento della frazione utilizzando il software, premere il pulsante Misura e uno strumento di linea verticale per definire le dimensioni interne del ventricolo sinistro end-sistolico e telediastolico. Il software calcola automaticamente l’accorciamento della frazione percentuale (FS). Ridurre la concentrazione di isoflurano allo 0% e attendere circa 5 minuti fino a quando l’animale riacquista una coscienza sufficiente per mantenere il decubito sternale. 6. Immunoistochimica Fissare il corpo sottoposto a eutanasia (eseguire l’eutanasia come al punto 1.1.3) sul tavolo utilizzando i nastri chirurgici tagliati, asportare i cuori, lavare con PBS e immergere il cuore in paraformaldeide/PBS al 4%. Sezionare i cuori in tre sezioni, immergerli in saccarosio al 40% per la crioprotezione, incorporarli in un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) e congelarli a -80 °C. Fissare i tessuti criosezionati (8 μm di spessore) a vetrini rivestiti di aminosilano. Dopo un’asciugatura sufficiente utilizzando il vento non riscaldato generato da un asciugacapelli generico, immergere i vetrini in soluzione salina tamponata tris contenente lo 0,2% di Tween-20 (TBS-T). Immergerli in una soluzione bloccante per 30 minuti a 25 °C. Versare 100 μL della soluzione bloccante contenente anticorpi primari sul vetrino e incubare per una notte a 4 °C con sigillante di paraffina per mantenere la soluzione anticorpale distribuita sul tessuto.NOTA: La concentrazione di anticorpi è indicata nella tabella dei materiali. Appoggia i vetrini orizzontalmente in una scatola ad alta umidità fatta a mano utilizzando il vapore naturale della carta bagnata per evitare l’evaporazione. Lavare i vetrini tre volte con TBS-T. Trattare con l’agente bloccante contenente anticorpi secondari per 1 ora a 25 °C allo stesso modo dell’anticorpo primario. Dopo tre lavaggi, osservare i segnali di fluorescenza utilizzando un microscopio a fluorescenza e un microscopio laser confocale.NOTA: La concentrazione di anticorpi è indicata nella tabella dei materiali. Analisi statistica: per il confronto del volume cellulare, come mostrato nella Figura 3A, eseguire un test t non accoppiato; per valutare il recupero funzionale cardiaco dopo la somministrazione di cardiomiociti con il metodo dell’iniezione lenta, come mostrato nella Figura 4A, utilizzare un test t accoppiato. In questo lavoro, le differenze sono state considerate statisticamente significative a P < 0,01. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard.