Minimum İnvazyon ile Yeni Bir Hücre Enjeksiyon Yöntemi

Hayvan deneyleri, Kansai-Tıp Üniversitesi hayvan deneyleri için etik yönergelere göre yürütülmüş ve etik kurullar tarafından onaylanmıştır (onay numarası: 23-104). Tüm hayvanlar, belirli bir patojen içermeyen ortamda sabit bir aydınlık-karanlık döngüsü altında yetiştirildi. Makas, forseps ve ekartör gibi sterilize edilmiş tüm cerrahi aletler otoklavlandı ve iyice kurutuldu. 1. Yenidoğan sıçan kardiyomiyosit toplarının hazırlanması Yenidoğan sıçan kalbi koleksiyonuKalp toplanması için, önceki bir raporda7 açıklanana benzer bir prosedür izleyin. Yenidoğan (doğumdan 0-2 gün sonra) Sprague-Dawley (SD) sıçanlarını sırayla povidon-iyot ve% 70 etanol çözeltilerine daldırın ve daha sonra buharlaştırılmış izofluran ile doldurulmuş hava geçirmez bir kutuya aktarın (konsantrasyon% 10 v / v’nin üzerinde olmalıdır) derin anestezi için. Lokomotor aktivite kaybı ile bilinç kaybının doğrulanmasından sonra, vücudu arkadan el ile tutan sıçanın başını kesin ve daha sonra keskin bir makas kullanarak göğüs kafesinin ön merkezinden kaudal’a ve daha sonra rostral yönde 2-4 mm doku kesin. Kesiği açmak için arka deriyi kavrayın ve kalbi göğüs kafesinden dışarı doğru itin. Ventrikülleri makas kullanarak kesin ve kalsiyum veya magnezyum (PBS(-)) içermeyen fosfat tamponlu salin (PBS) içine daldırın. Yenidoğan sıçan kardiyomiyositlerinin dağılımıToplanan karıncıklar minimum miktarda Ad tamponu (Ads tamponu: 116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 12.5 mM NaH2PO 4, 5.6 mM glukoz,5.4 mM KCl, 0.8 mMMgS04, pH 7.35) içinde dağılmış halde otoklavlanmış içbükey cam kaplar içinde kavisli makas kullanarak küçük parçalar halinde (1 mm x 1 mm) doğrayın. Kıyılmış dokuları ve bir mikro-manyetik karıştırıcıyı 50 mL’lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve dokuları 30 dakika karıştırarak 37 °C’de Ads tamponunda %0.1 kollajenaz, %0.1 tripsin, 20 μg/mL DNaz I ve 50 nM tetrametilrodamin metil ester ile tek hücrelere dağıtın. Agregaları ve dağılmış hücreleri doğal sedimantasyon yoluyla ayırın, sadece dağılmış hücreleri bir tüpte toplayın ve artık hücre agregalarını aynı sindirim ortamı ile tekrar sindirin. Tüm hücreler tamamen ayrılana kadar bu işleme devam edin. Hücrelerin tam dağılımını doğrulamak için, tüpleri mikroskop altında gözlemleyin (4x objektif lens). Dağılmış hücreleri 5 dakika boyunca 150 x g’da santrifüjleme kullanarak toplayın ve bunları 1-2 mL Ads tamponunda ayrıştırın. Kardiyomiyositlerin floresanla aktive edilen hücre sınıflandırmasıKırmızı floresan sinyallerini algılamak için 556-601 nm bant geçiren filtreler kullanarak floresanla aktive edilen hücre sıralamasını (FACS) kullanarak hücreleri analiz edin. İkili kesirleri ortadan kaldırmak için dikkatlice ön geçitleme yapın14. İkili eleme için kapı ayarları, üreticinin talimatlarına göre yapılmalıdır. X ekseninde ileri saçılımı ve y ekseninde kırmızı floresan sinyalini ayarlayın. Üç popülasyon gözlendi: eritrositler ve ölü hücreler içeren en düşük popülasyon, fibroblastlar ve endotel hücreleri dahil olmak üzere kardiyomiyosit olmayan bir orta popülasyon ve saf ventriküler kardiyomiyositler içeren bir üst popülasyon7. Kırmızı floresan etiketli kardiyomiyosit toplarının hazırlanmasıKardiyomiyositleri seçici olarak sıralayın ve 150 x g’da 5 dakika santrifüjleyin. Hücre peletlerini% 10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS) içeren 1 mL alfa modifiye minimal esansiyel ortam (alfa-MEM) içinde tamamen çözün. Bir hemositometre kullanarak hücre konsantrasyonunu ölçün ve hücre süspansiyon çözeltisini alfa-MEM% 10 FBS ile 3.000 hücre / mL’ye seyreltin. Bunları hücre yapışkan olmayan 96 oyuklu plakalara (oyuk başına 100 μL) dağıtın, 100 x g’da 5 dakika santrifüjleyin ve 37 ° C’de% 5 CO 2 içeren bir hücre kültürü inkübatöründe2-3 gün kültürleyin. Enjeksiyon deneylerinden önce, 1.000 μL’lik bir pipet kullanarak kültür ortamı ile aspirasyon yoluyla her bir oyuktan bir kardiyomiyosit topu toplayın ve bunları 15 mL’lik bir tüpte toplayın. Aşılamadan sonra izleme için üreticinin talimatlarını izleyerek PKH26 ile boyayın. 2. Yavaş enjeksiyon yöntemi için hazırlıklar Jelatin stok çözeltisinin hazırlanmasıJelatini tartın, w/v çözelti üretmek için Ads tamponunda çözün ve otoklavlayın. Hücre enjeksiyon cihazı üretimiGenel cihaz tasarımı: Şekil 1’de gösterilen aparatı hazırlayın. Bu sistem bir şırınga soğutma aparatı ve ana enjeksiyon aparatı ile birleştirilmiştir. Aşağıda açıklanan ana enjeksiyon aparatını hazırlayın:Yenidoğan kardiyomiyosit top enjeksiyonu için, bir şırınga ile donatılmış 29 G, 50 mm uzunluğunda bir iğne kullanın. Bir hücre enjeksiyon şırıngası kullanarak bir güç aktarım şırıngasını (18G, 1 mL) arka arkaya bağlayın (Şekil 1). Güç transfer şırıngasının iğnesini düşük lümen genişletilebilirliğine sahip ince bir polipropilen tüpe bağlayın. Ardından, güç transfer tüpünün diğer tarafını aynı şırınganın iğnesine (18G, 1 mL) bağlayın ve bir şırınga pompasına yerleştirin. İki güç aktarım şırıngasını ve tüpünü hava kabarcığı olmadan suyla doldurun.NOT: Güç aktarım şırıngasının bir pistonu içeri itildiğinde, basınç doğrudan diğer şırıngaya aktarılır ve piston dışarı çıkar. Enjeksiyon şırınga soğutma sistemini aşağıda açıklandığı gibi kurun.Bir bakır boruyu (dış çap = 1 mm; iç çap = 0.3 mm; kalınlık = 0.35 mm) hücre enjeksiyon şırıngasının hücre içeren kısmının etrafına sıkıca sarın ve her iki ucunda 10 mm fazla boru bırakın. Bakır boruyu esnek plastik boruya bağlayın. Ayrıca, plastik borunun diğer uçlarını harici bir pompaya bağlayın, hattı soğutma suyuyla doldurun ve fazla bakır boruyu kırılmış buza batırarak suyu soğutun (Şekil 1).NOT: Bu soğutma sistemi, silindirdeki hücre süspansiyon çözeltisini yaklaşık 2 °C’de tutar. 3. Geniş koroner arter tıkanıklığı ile sıçan miyokard enfarktüsü modelinin geliştirilmesi Erkek bağışıklık eksikliği olan çıplak sıçanları (F344 / Njcl-rnu / rnu)% 3 izofluran içeren hava ile uyuşturun. Trakeaya bir kanül yerleştirin ve solunum cihazına bağlayın. % 3’lük bir izofluran konsantrasyonunu korumak ve böylece yeterli anesteziyi sürdürmek için bir kanülü bir kontrolör ile bir izofluran buharlaştırıcıya bağlayın. Ağrı uyaranlarına yanıt vermediğinizi onaylayın. Kuruluğu önlemek için gözlere veteriner merhemi sürün. Uzuvları kesilmiş cerrahi bantlarla 40 °C ısıtılmış bir cerrahi plakaya sabitleyin. Sıçanın vücudunu vücut ekseninin sağına doğru bükün ve sol koltuk altını cerrahi alan olarak kullanın. Tüy dökücü bir krem kullanarak cerrahi alandaki tüyleri alın ve cildi povidon-iyot ile silin. Keskin bir makas kullanarak ciltte ve pektoralis majör kasında 1,5 cm’lik bir kesi kesin. Üçüncü interkostal boşluğu onaylayın ve künt uçlu mikro forseps kullanarak interkostal kasları ve kostal plevrayı yırtın. Bir ekartör kullanarak göğsü açık tutun. İnce perikardları forseps ile yavaşça çıkarın. Kalbin yan duvarının bir enfarktüs modelini oluşturmak için, geniş koroner arteri tanımlamak için sol atriyumun ucuna 1 mm kaudal pozisyonu bulun, 7-0 ipek sütür atın, dorsalden ventrale 2,5 mm genişliğinde ve 2,5 mm derinliğinde dokuyu alın ve dokuyu sıkıca bağlayın. Ligatürden distaldeki zayıf kasılma ile başarılı ligasyonu onaylayın. Ekartörü nazikçe çıkardıktan sonra, ikinci ve dördüncü interkostal boşluklar arasına 5-0 ipek sütür yerleştirin ve torakotomiyi kapatın. İzofluran konsantrasyonunu% 1’e düşürün. Kas ve cildi 5-0 ipek ile nazikçe dikin. İzofluran konsantrasyonunu% 0’a düşürün ve spontan solunum başlayana kadar yaklaşık 5 dakika bekleyin. Topikal olarak 2 mg / mL lidokaini salin içinde insizyona uygulayın. Deri altı enjeksiyonu ile 1 mL salin uygulayın. Enfeksiyonları önlemek için veteriner merhemini topikal olarak uygulayın. Fareyi entübasyon tüpünden çıkarın ve hayvan kafesine geri dönün; Ardından, fareleri 1 hafta boyunca ayrı kafeslerde büyütün. Ekokardiyografi kullanarak kardiyak sistolik pompa fonksiyonundaki değişiklikleri analiz edin.NOT: Lateral miyokard enfarktüsü nedeniyle kardiyak fonksiyon azalacaktır. 4. Yavaş enjeksiyon yöntemi kullanılarak eko kılavuzluğunda perkütan hücre nakli jelatin stoğunu sıvı hale gelene kadar 37 °C’de önceden ısıtın. Nihai enjekte edilebilir %5 w/v jelatin çözeltisini elde etmek için jelatin stoğunu önceden ısıtılmış Ads tamponu ile seyreltin (hayvan başına 100 μL gereklidir). 96 kardiyomiyosit topunu (toplam: 28.800 kardiyomiyosit / hayvan) 100 μL önceden ısıtılmış enjeksiyon çözeltisinde askıya alın. Adım 4.3’te hazırlanan süspansiyonu, fazla hava aspirasyonunu önleyerek hücre enjeksiyon şırıngasına yükleyin. Şırıngadaki kabarcıkları ortadan kaldırmak için, iğne yukarı bakacak şekilde dikey olarak tutun, şırıngaya hafifçe vurun ve şırınganın üst sırtındaki kabarcıkları toplayın.NOT: Bu adım sırasında, kardiyomiyosit toplarının yavaş yavaş pistonun lastik contasına yerleştiğini gözlemleyin. Şırınganın dikey konumunu koruyun, pistonu yavaşça yukarı itin ve şırıngada 20 μL hücre süspansiyonu kalana kadar kabarcıkları ve fazla hücre süspansiyon çözeltisini atın. Pistonu, kardiyomiyosit topunun pistonun lastik contası üzerinde durması için sabit bir hızda dikkatlice itin. Kapaklı şırıngayı 5 dakika boyunca doğrudan bir buz banyosuna daldırın. Enjeksiyon aparatına soğutulmuş bir şırınga yerleştirin. X-Y-Z konumu ayarlanabilir el yapımı bir kelepçe kullanarak hayvan sahnesinde ince bir hareket cihazına yerleştirilmiş enjeksiyon şırınga aparatını sıkıca sabitleyin. İnce hareket cihazı, x yönünde 20 mm sürgü, y yönünde dönüş ve z yönünde eğilme hareketlerini kullanarak iğne konumunu hareket ettirebilir. Sıçanları% 3 izofluran içeren hava ile dolu kapalı bir kutuda uyuşturun. Ağrı uyaranlarına yanıt vermeden anesteziyi onaylayın. Kuruluğu önlemek için gözlere veteriner merhemi sürün. Uzuvları kesilmiş cerrahi bantlarla 40 °C ısıtılmış eko plakasına sabitleyin. Yeterli anesteziyi sürdürmek için, solunan havanın yaklaşık% 3 izofluran konsantrasyonu içerdiğinden emin olun. Enjeksiyon alanındaki (2 cm çapında) ve göğsündeki tüyleri tüy dökücü kremle alın ve cildi povidon-iyot ile silin. Göğse eko-jel uygulayın ve eko probu yapın. Eko probunu kraniyal ve kaudal eksenler boyunca göğse yakın bir yere yerleştirin ve üretici kılavuzunu izleyerek B-mod ekokardiyografi almaya başlayın. Enjeksiyon iğnesinin ucunu önden görünümde miyokardın içine ilerletin (Şekil 2 ve Ek Video 1). Ana şırınga pompasını etkinleştirmek için Başlat düğmesine basın ve yaklaşık 0.02 μL/s’lik bir enjeksiyon hızı için önceden belirlenmiş bir sayıya ayarlamak için kadranı çevirin. Enfeksiyonları önlemek için veteriner merhemini iğneleme pozisyonunun etrafına topikal olarak uygulayın.NOT: Bir enjeksiyon solüsyonu kullanılarak amaçlanan enjeksiyon hızı için uygun arama numarasının belirlenmesi gerekir. Enjeksiyondan sonra, örnek bir hareket sistemi kullanarak enjeksiyon iğnesini çıkarın. İzofluran konsantrasyonunu% 0’a düşürün ve hayvan sternal yaslığı korumak için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar yaklaşık 5 dakika bekleyin. 5. Kardiyak fonksiyonun değerlendirilmesi Sıçanları% 3 izofluran içeren hava ile dolu kapalı bir kutuda uyuşturun. Ağrı uyaranlarına yanıt vermeden anesteziyi onaylayın. Kuruluğu önlemek için gözlere veteriner merhemi sürün. Uzuv uçlarına EKG alımı için elektriklendirici krem sürün. Uzuvları kesilmiş cerrahi bantlarla 40 °C ısıtılmış eko plakasına sabitleyin. Gerçek zamanlı EKG ve kalp atış hızını tespit etmek için fizyolojik bir izleme sistemi kullanın. Üreticinin talimatlarına göre, önce sol ventrikül apeksi çıkış yoluna gösteren B-modu yankı görüntüsünü kullanarak uzun eksen açısını belirleyin ve ardından kısa eksene geçmek için yankı probunu 90° döndürün. Hayvan aşamasının yalnızca kaudal-rostral eksen ince hareket sistemini kullanarak, kısa eksen görünümünü papiller kas seviyesine ayarlayın. Ardından, M modu düğmesine basarak görüntü modunu M moduna değiştirin ve Cine-loop düğmesine basarak 5 saniye boyunca bir video kaydedin. Yazılımı kullanarak fraksiyon kısalmasını analiz etmek ve hesaplamak için, sistolik sonu ve diyastol sonu sol ventrikül iç boyutlarını tanımlamak için Ölç düğmesine ve dikey çizgi aracına basın. Yazılım, yüzde kesir kısalmasını (FS) otomatik olarak hesaplar. İzofluran konsantrasyonunu% 0’a düşürün ve hayvan sternal yaslığı korumak için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar yaklaşık 5 dakika bekleyin. 6. İmmünohistokimya Kesilen cerrahi bantları kullanarak ötenazi yapılmış vücudu (adım 1.1.3’teki gibi ötenazi yapın) masaya sabitleyin, kalpleri çıkarın, PBS ile yıkayın ve kalbi %4 paraformaldehit/PBS’ye daldırın. Kalpleri üç bölüme ayırın, kriyoproteksiyon için sükroza daldırın, optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğine gömün ve -80 °C’de dondurun. Kriyoseksiyonel dokuları (8 μm kalınlığında) aminosilan kaplı cam slaytlara takın. Genel bir saç kurutma makinesi tarafından üretilen ısıtılmamış rüzgarı kullanarak yeterli kurutmadan sonra, cam slaytları %0,2 Tween-20 (TBS-T) içeren üç tamponlu tuzlu suya daldırın. Bunları 25 ° C’de 30 dakika boyunca bir engelleme solüsyonuna daldırın. Birincil antikor içeren bloke edici solüsyonun 100 μL’sini slayt üzerine dökün ve antikor solüsyonunun doku üzerinde yayılmasını sağlamak için gece boyunca 4 ° C’de parafin sızdırmazlığı ile inkübe edin.NOT: Antikor konsantrasyonu Malzeme Tablosunda gösterilmiştir. Buharlaşmayı önlemek için ıslak kağıttan gelen doğal buharı kullanarak slaytları el yapımı yüksek nemli bir kutuya yatay olarak yerleştirin. Slaytları TBS-T ile üç kez yıkayın. İkincil antikor içeren bloke edici ajan ile 25 ° C’de 1 saat boyunca birincil antikorla aynı şekilde tedavi edin. Üç yıkamadan sonra, bir floresan mikroskobu ve konfokal lazer mikroskobu kullanarak floresan sinyallerini gözlemleyin.NOT: Antikor konsantrasyonu Malzeme Tablosunda gösterilmiştir. İstatistiksel analiz: Hücre hacmi karşılaştırması için, Şekil 3A’da gösterildiği gibi, eşlenmemiş bir t-testi gerçekleştirin; Şekil 4A’da gösterildiği gibi yavaş enjeksiyon yöntemi kullanılarak kardiyomiyosit uygulamasını takiben kardiyak fonksiyonel iyileşmeyi değerlendirmek için eşleştirilmiş bir t-testi kullanın. Bu çalışmada farklılıklar P < .01'de istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. Hata çubukları standart sapmayı temsil eder.