Eine neuartige Zellinjektionsmethode mit minimaler Invasion

Die Tierversuche wurden nach den ethischen Richtlinien für Tierversuche der Kansai-Medical University durchgeführt und von den Ethikkommissionen genehmigt (Zulassungsnummer: 23-104). Alle Tiere wurden unter einem konstanten Hell-Dunkel-Zyklus in einer spezifischen, pathogenfreien Umgebung aufgezogen. Alle sterilisierten chirurgischen Instrumente wie Scheren, Pinzetten und Retraktoren wurden autoklaviert und gründlich getrocknet. 1. Vorbereitung der Kardiomyozytenkugeln der neugeborenen Ratte Sammlung von Rattenherzen für NeugeboreneBefolgen Sie für die Herzentnahme ein ähnliches Verfahren wie in einem früheren Bericht7. Neugeborene (0-2 Tage nach der Geburt) Sprague-Dawley (SD)-Ratten nacheinander in Povidon-Jod- und 70%ige Ethanollösungen eintauchen und dann zur Tiefenanästhesie in ein luftdichtes Gehäuse überführen, das mit verdampftem Isofluran gefüllt ist (die Konzentration sollte über 10 % v/v liegen). Nach der Bestätigung der Bewusstlosigkeit durch einen Verlust der Bewegungsaktivität enthaupten Sie die Ratte, während Sie den Körper von hinten mit der Hand halten, und schneiden dann 2-4 mm Gewebe von der vorderen Mitte des Brustkorbs bis zum Schwanz und dann in rostraler Richtung mit einer scharfen Schere. Fassen Sie die Rückenhaut an, um die Schnittwunde aufzureißen und das Herz aus dem Brustkorb herauszudrücken. Schneiden Sie die Ventrikel mit einer Schere ab und tauchen Sie sie in phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ohne Kalzium oder Magnesium (PBS(−)). Ausbreitung der neonatalen Ratten-KardiomyozytenZerkleinern Sie die gesammelten Ventrikel dispergiert in einer minimalen Menge ADS-Puffer (ADS-Puffer: 116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 12,5 mM NaH2PO 4, 5,6 mM Glukose, 5,4 mM KCl, 0,8 mM MgSO4, pH 7,35) in einem autoklavierten konkaven Glas mit einer gebogenen Schere in kleine Stücke (1 mm x 1 mm). Die zerkleinerten Gewebe und ein mikromagnetischer Rührer werden in ein 50-ml-Zentrifugationsröhrchen überführt und die Gewebe mit 0,1 % Kollagenase, 0,1 % Trypsin, 20 μg/ml DNase I und 50 nM Tetramethylrhodaminmethylester in Ads-Puffer bei 37 °C durch Rühren 30 Minuten lang in Einzelzellen dispergiert. Trennen Sie die Aggregate und dispergierten Zellen durch natürliche Sedimentation, sammeln Sie nur die dispergierten Zellen in einem Röhrchen und verdauen Sie die verbleibenden Zellaggregate erneut mit demselben Aufschlussmedium. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Zellen vollständig dissoziiert sind. Um die vollständige Dispersion der Zellen zu bestätigen, werden die Röhren unter dem Mikroskop (4x Objektivlinse) beobachtet. Die dispergierten Zellen werden durch Zentrifugation bei 150 x g für 5 min gesammelt und in 1-2 ml ADS-Puffer dissoziiert. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung von KardiomyozytenAnalysieren Sie die Zellen mit Hilfe von Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) unter Verwendung von 556-601-nm-Bandpassfiltern, um rote Fluoreszenzsignale zu erkennen. Führen Sie die Vorbeugung sorgfältig durch, um Dublettenfraktionenzu eliminieren 14. Die Gate-Einstellungen für die Dubletten-Eliminierung sollten den Anweisungen des Herstellers entsprechen. Stellen Sie die Vorwärtsstreuung auf der x-Achse und das rote Fluoreszenzsignal auf der y-Achse ein. Es wurden drei Populationen beobachtet: eine unterste Population mit Erythrozyten und toten Zellen, eine mittlere Population mit Nicht-Kardiomyozyten, einschließlich Fibroblasten und Endothelzellen, und eine Top-Population mit reinen ventrikulären Kardiomyozyten7. Herstellung von rot fluoreszenzmarkierten KardiomyozytenkugelnDie Kardiomyozyten werden selektiv sortiert und 5 Minuten lang bei 150 x g zentrifugiert. Lösen Sie die Zellpellets vollständig in 1 ml alpha-modifiziertem minimalem essentiellem Medium (alpha-MEM) auf, das 10 % hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (FBS) enthält. Messen Sie die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer und verdünnen Sie die Zellsuspensionslösung mit Alpha-MEM 10% FBS auf 3.000 Zellen/ml. Verteilen Sie sie in nicht klebenden 96-Well-Platten (100 μl pro Well), zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 100 x g und kultivieren Sie sie 2-3 Tage lang in einem Zellkulturinkubator mit 5 % CO2 bei 37 °C. Vor den Injektionsexperimenten wird aus jeder Vertiefung eine Kardiomyozytenkugel durch Aspiration mit dem Nährmedium mit einer 1.000-μl-Pipette entnommen und in einem 15-ml-Röhrchen gesammelt. Färben Sie mit PKH26 gemäß den Anweisungen des Herstellers zur Nachverfolgung nach der Transplantation. 2. Vorbereitungen für die Methode der langsamen Injektion Herstellung der Gelatine-StammlösungWiegen Sie die Gelatine, lösen Sie sie in Ads-Puffer auf, um eine 10%ige w/v-Lösung herzustellen, und autoklavieren Sie sie. Herstellung eines ZellinjektionsgerätsGesamtauslegung des Geräts: Bereiten Sie das in Abbildung 1 gezeigte Gerät vor. Dieses System ist mit einer Spritzenkühlvorrichtung und einer Hauptinjektionsvorrichtung kombiniert. Bereiten Sie das unten beschriebene Hauptinjektionsgerät vor:Verwenden Sie für eine neonatale Kardiomyozytenkugel-Injektion eine 29 g lange, 50 mm lange Nadel, die mit einer Spritze ausgestattet ist. Schließen Sie eine Power-Transfer-Spritze (18 G, 1 ml) Rücken an Rücken mit einer Zellinjektionsspritze an (Abbildung 1). Verbinden Sie die Nadel der Kraftübertragungsspritze mit einem dünnen Polypropylenschlauch mit geringer Lumendehnbarkeit. Verbinden Sie dann die andere Seite des Kraftübertragungsschlauchs mit der Nadel derselben Spritze (18 G, 1 ml) und setzen Sie sie in eine Spritzenpumpe. Füllen Sie die beiden Power-Transfer-Spritzen und -Röhrchen mit Wasser ohne Luftblasen.HINWEIS: Wenn ein Kolben der Kraftübertragungsspritze hineingedrückt wird, wird der Druck direkt auf die andere Spritze übertragen, und der Kolben ragt heraus. Richten Sie das Kühlsystem der Injektionsspritze wie unten beschrieben ein.Wickeln Sie ein Kupferrohr (Außendurchmesser = 1 mm; Innendurchmesser = 0,3 mm; Dicke = 0,35 mm) fest um den zellhaltigen Teil der Zellinjektionsspritze, wobei an beiden Enden 10 mm überschüssiges Rohr übrig bleiben. Verbinden Sie das Kupferrohr mit einem flexiblen Kunststoffschlauch. Schließen Sie außerdem die anderen Enden des Kunststoffschlauchs an eine externe Pumpe an, füllen Sie die Leitung mit Kühlwasser und kühlen Sie das Wasser, indem Sie das überschüssige Kupferrohr in Crushed Ice tauchen (Abbildung 1).HINWEIS: Dieses Kühlsystem hält die Zellsuspensionslösung im Zylinder bei ca. 2 °C. 3. Entwicklung eines Ratten-Myokardinfarktmodells durch stumpfen Koronararterienverschluss Männliche immundefiziente Nacktratten (F344/Njcl-rnu/rnu) werden mit Luft anästhesiert, die 3% Isofluran enthält. Führen Sie eine Kanüle in die Luftröhre ein und schließen Sie sie an das Beatmungsgerät an. Schließen Sie eine Kanüle an einen Isofluran-Verdampfer mit einem Controller an, um eine Isofluran-Konzentration von 3 % aufrechtzuerhalten und somit eine ausreichende Anästhesie aufrechtzuerhalten. Bestätigen Sie, dass Sie nicht auf Schmerzreize reagieren. Tragen Sie Tiersalbe auf die Augen auf, um Trockenheit zu verhindern. Fixieren Sie die Gliedmaßen mit abgeschnittenen OP-Bändern auf einer 40 °C erwärmten OP-Platte. Drehen Sie den Körper der Ratte nach rechts von der Körperachse und nutzen Sie die linke Achselhöhle als Operationsfeld. Entfernen Sie die Haare im Operationsfeld mit einer Enthaarungscreme und wischen Sie die Haut mit Povidon-Jod ab. Schneiden Sie mit einer scharfen Schere einen 1,5 cm langen Schnitt in die Haut und den großen Brustmuskel. Bestätigen Sie den dritten Zwischenrippenraum und reißen Sie die Zwischenrippenmuskeln und das Rippenfell mit einer Mikropinzette mit stumpfen Spitzen auf. Halten Sie die Brust mit einem Retraktor offen. Entfernen Sie den dünnen Herzbeutel vorsichtig mit einer Pinzette. Um ein Infarktmodell der lateralen Wand des Herzens zu konstruieren, finden Sie die Position 1 mm kaudal zur Spitze des linken Vorhofs, um die stumpfe Koronararterie zu identifizieren, führen Sie eine 7-0-Seidennaht durch, schöpfen Sie 2,5 mm breites und 2,5 mm tiefes Gewebe von dorsal nach ventral und ligieren Sie das Gewebe fest. Bestätigen Sie die erfolgreiche Ligatur durch die schwache Kontraktion distal der Ligatur. Nachdem Sie den Retraktor vorsichtig entfernt haben, legen Sie eine 5-0-Seidennaht zwischen den zweiten und vierten Zwischenrippenraum und schließen Sie die Thorakotomie. Verringern Sie die Isoflurankonzentration auf 1%. Vernähen Sie den Muskel und die Haut sanft mit 5-0 Seide. Verringern Sie die Isoflurankonzentration auf 0 % und warten Sie ca. 5 Minuten, bis die Spontanatmung einsetzt. Tragen Sie topisch 2 mg/ml Lidocain in Kochsalzlösung auf den Einschnitt auf. Verabreichen Sie 1 ml Kochsalzlösung über eine subkutane Injektion. Tragen Sie die Tiersalbe topisch auf, um Infektionen vorzubeugen. Nehmen Sie die Ratte aus dem Intubationsschlauch und kehren Sie in den Tierkäfig zurück. Dann ziehen Sie die Ratten 1 Woche lang in einzelnen Käfigen auf. Analysieren Sie die Veränderungen der systolischen Pumpenfunktion des Herzens mittels Echokardiographie.HINWEIS: Die Herzfunktion wird aufgrund eines lateralen Myokardinfarkts eingeschränkt. 4. Echogesteuerte perkutane Zelltransplantation mit der Methode der langsamen Injektion 10%ige Gelatinebrühe bei 37 °C vorwärmen, bis sie flüssig ist. Verdünnen Sie 10 % Gelatine mit vorgewärmtem ADS-Puffer, um die endgültige injizierbare 5%ige Gelatinelösung zu erhalten (100 μl sind pro Tier erforderlich). Suspendieren Sie 96 Kardiomyozytenkugeln (insgesamt: 28.800 Kardiomyozyten/Tier) in 100 μl vorgewärmter Injektionslösung. Die in Schritt 4.3 vorbereitete Suspension wird in die Zellinjektionsspritze gegeben, wobei das Ansaugen von überschüssiger Luft vermieden wird. Um Blasen in der Spritze zu beseitigen, halten Sie sie senkrecht mit der Nadel nach oben, klopfen Sie auf die Spritze und sammeln Sie alle Blasen am oberen Grat der Spritze.HINWEIS: Beobachten Sie während dieses Schritts, wie sich die Kardiomyozytenkugeln allmählich auf der Gummidichtung des Kolbens absetzen. Behalten Sie die vertikale Position der Spritze bei, drücken Sie den Kolben langsam nach oben und entsorgen Sie die Blasen und die überschüssige Zellsuspensionslösung, bis 20 μl der Zellsuspension in der Spritze verbleiben. Drücken Sie den Kolben vorsichtig mit konstanter Geschwindigkeit, so dass die Kardiomyozytenkugel auf der Gummidichtung des Kolbens aufliegt. Tauchen Sie die Spritze mit Verschluss 5 Minuten lang direkt in ein Eisbad. Legen Sie eine gekühlte Spritze in das Injektionsgerät. Fixieren Sie den Injektionsspritzenapparat auf einer feinen Bewegungsvorrichtung auf der Tierbühne mit einer X-Y-Z-Position, einer handgefertigten Klemme. Das Feinbewegungsgerät kann die Nadelposition mit den 20-mm-Schlittenbewegungen in x-Richtung, y-Richtung und z-Richtung bewegen. Betäuben Sie die Ratten in einem versiegelten Kasten, der mit Luft gefüllt ist, die 3% Isofluran enthält. Bestätigen Sie die Anästhesie, indem Sie nicht auf Schmerzreize reagieren. Tragen Sie Tiersalbe auf die Augen auf, um Trockenheit zu verhindern. Fixieren Sie die Gliedmaßen mit abgeschnittenen chirurgischen Klebebändern auf einer 40 °C erwärmten Echoplatte. Um eine ausreichende Anästhesie aufrechtzuerhalten, stellen Sie sicher, dass die eingeatmete Luft eine Konzentration von etwa 3 % Isofluran enthält. Entfernen Sie die Haare am Injektionsfeld (2 cm Durchmesser) und an der Brust mit Enthaarungscreme und wischen Sie die Haut mit Povidon-Jod ab. Tragen Sie Echo-Gel auf die Brust und die Echosonde auf. Platzieren Sie die Echosonde nahe an der Brust entlang der Schädel- und Schwanzachse und beginnen Sie mit der B-Mode-Echokardiographie gemäß der Bedienungsanleitung des Herstellers. Schieben Sie die Spitze der Injektionsnadel in der Frontalansicht in den Herzmuskel (Abbildung 2 und ergänzendes Video 1). Um die Hauptspritzenpumpe zu aktivieren, drücken Sie die Start-Taste und drehen Sie den Drehknopf, um eine vorgegebene Zahl für eine Injektionsgeschwindigkeit von ca. 0,02 μl/s einzustellen. Tragen Sie die Tiersalbe topisch um die Nadelposition herum auf, um Infektionen zu vermeiden.HINWEIS: Es ist notwendig, die entsprechende Wählnummer für die vorgesehene Einspritzgeschwindigkeit mit einer Einspritzlösung zu bestimmen. Nach der Injektion entfernen Sie die Injektionsnadel mit einem vorbildlichen Bewegungssystem. Verringern Sie die Isoflurankonzentration auf 0 % und warten Sie ca. 5 Minuten, bis das Tier wieder zu Bewusstsein kommt, um das Brustbein zu halten. 5. Beurteilung der Herzfunktion Betäuben Sie die Ratten in einem versiegelten Kasten, der mit Luft gefüllt ist, die 3% Isofluran enthält. Bestätigen Sie die Anästhesie, indem Sie nicht auf Schmerzreize reagieren. Tragen Sie Tiersalbe auf die Augen auf, um Trockenheit zu verhindern. Tragen Sie die elektrisierende Creme für die EKG-Erfassung auf die Gliedmaßenspitzen auf. Fixieren Sie die Gliedmaßen mit abgeschnittenen chirurgischen Klebebändern auf einer 40 °C erwärmten Echoplatte. Verwenden Sie ein physiologisches Überwachungssystem, um EKG und Herzfrequenz in Echtzeit zu erfassen. Bestimmen Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers zunächst den Winkel der Längsachse anhand des B-Modus-Echobildes, das die linksventrikuläre Spitze zum Ausflusstrakt zeigt, und drehen Sie dann die Echosonde um 90°, um in die Kurzachsenansicht zu wechseln. Verwenden Sie nur das feine Bewegungssystem der kaudalen bis rostralen Achse des Tierstadiums und passen Sie die Kurzachsenansicht an die Höhe der Papillarmuskulatur an. Wechseln Sie dann den Bildmodus in den M-Modus, indem Sie die M-Modus-Taste drücken, und nehmen Sie 5 Sekunden lang ein Video auf, indem Sie die Cine-Loop-Taste drücken. Um die Fraktionsverkürzung mit der Software zu analysieren und zu berechnen, drücken Sie die Schaltfläche Messen und ein vertikales Linienwerkzeug, um die endsystolischen und enddiastolischen linksventrikulären Innenmaße zu definieren. Die Software berechnet automatisch die prozentuale Bruchverkürzung (FS). Verringern Sie die Isoflurankonzentration auf 0 % und warten Sie ca. 5 Minuten, bis das Tier wieder zu Bewusstsein kommt, um das Brustbein zu halten. 6. Immunhistochemie Fixieren Sie den euthanasierten Körper (Euthanasie wie in Schritt 1.1.3 beschrieben) auf dem Tisch mit den zerschnittenen chirurgischen Bändern, schneiden Sie die Herzen heraus, waschen Sie sie mit PBS und tauchen Sie das Herz in 4% Paraformaldehyd/PBS. Die Herzen werden in drei Abschnitte zerlegt, zum Kryoschutz in 40%ige Saccharose getaucht, in eine OCT-Verbindung (Optimal Cutting Temperature) eingebettet und bei −80 °C eingefroren. Befestigen Sie die kryosektionierten Gewebe (8 μm Dicke) auf mit Aminosilan beschichteten Objektträgern. Nach ausreichender Trocknung mit nicht erwärmtem Wind, der von einem allgemeinen Haartrockner erzeugt wird, tauchen Sie die Objektträger in Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit 0,2 % Tween-20 (TBS-T). Tauchen Sie sie für 30 Minuten bei 25 °C in eine Blockierungslösung. Gießen Sie 100 μl der primären antikörperhaltigen Blockierungslösung auf den Objektträger und inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C mit Paraffinversiegelung, um die Antikörperlösung auf dem Gewebe verteilt zu halten.HINWEIS: Die Antikörperkonzentration ist in der Materialtabelle angegeben. Legen Sie die Objektträger horizontal in eine handgefertigte Box mit hoher Luftfeuchtigkeit und nutzen Sie den natürlichen Dampf des nassen Papiers, um eine Verdunstung zu verhindern. Waschen Sie die Objektträger dreimal mit TBS-T. Mit dem Sekundärantikörper-haltigen Blocker 1 h bei 25 °C auf die gleiche Weise wie mit dem Primärantikörper behandeln. Beobachten Sie nach drei Waschgängen die Fluoreszenzsignale mit einem Fluoreszenzmikroskop und einem konfokalen Lasermikroskop.HINWEIS: Die Antikörperkonzentration ist in der Materialtabelle angegeben. Statistische Analyse: Führen Sie für den Vergleich des Zellvolumens, wie in Abbildung 3A dargestellt, einen nicht gepaarten t-Test durch. Um die Wiederherstellung der Herzfunktion nach Verabreichung von Kardiomyozyten mit der langsamen Injektionsmethode zu beurteilen, wie in Abbildung 4A dargestellt, ist ein gepaarter t-Test zu verwenden. In dieser Arbeit wurden die Unterschiede bei P < 0,01 als statistisch signifikant angesehen. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar.