שיטת הזרקת תאים חדשנית עם מינימום פלישה

הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות האתיות של האוניברסיטה הרפואית לניסויים בבעלי חיים ואושרו על ידי ועדות האתיקה (מספר אישור: 23-104). כל בעלי החיים גודלו תחת מחזור אור-חושך קבוע בסביבה ספציפית נטולת פתוגנים. כל כלי הניתוח המעוקרים, כגון מספריים, מלקחיים ושליפות, עברו אוטוקלאבינג וייבוש יסודי. 1. הכנת כדורי קרדיומיוציטים של חולדה ניאונטלית אוסף לב חולדה בילודעבור איסוף הלב, בצע הליך דומה לזה שתואר בדוח קודם7. יש לטבול חולדות ילודים (0-2 ימים לאחר הלידה) בתמיסות פובידון-יוד ואתנול 70% ברצף, ולאחר מכן להעביר אותן למארז אטום מלא באיזופלורן מאדים (הריכוז צריך להיות מעל 10% v/v) להרדמה עמוקה. לאחר אישור של חוסר הכרה על ידי אובדן פעילות לוקומוטורית, לערוף את ראשה של החולדה תוך אחיזת הגוף מאחור עם היד, ולאחר מכן לחתוך 2-4 מ”מ של רקמה מהמרכז הקדמי של כלוב הצלעות אל הקאודל ולאחר מכן בכיוון rostral באמצעות מספריים חדים. אחזו בעור האחורי כדי לפתוח את החתך ודחפו את הלב החוצה מכלוב הצלעות. חתכו את החדרים באמצעות מספריים וטבלו אותם במי מלח חוצצי פוספט (PBS) ללא סידן או מגנזיום (PBS(−)). פיזור קרדיומיוציטים של חולדה בילודטחנו את החדרים שנאספו מפוזרים בכמות מינימלית של מאגר מודעות (מאגר מודעות: 116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 12.5 mM NaH2PO 4, 5.6 mM גלוקוז, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgSO4, pH 7.35) בכלי זכוכית קעורים אוטוקלאביים לחתיכות קטנות (1 מ”מ x 1 מ”מ) באמצעות מספריים מעוקלים. מעבירים את הרקמות הטחונות ואת הבוחש המיקרו-מגנטי לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מ”ל, ומפזרים את הרקמות לתאים בודדים עם 0.1% קולגן, 0.1% טריפסין, 20 מיקרוגרם/מ”ל DNase I ו-50 ננומטר טטרמתילרודאמין מתיל אסטר במאגר Ads ב-37°C על ידי ערבוב במשך 30 דקות. מפרידים את הצברים והתאים המפוזרים באמצעות שיקוע טבעי, אוספים רק את התאים המפוזרים לתוך צינור, ומעכלים שוב את צברי התאים השיוריים עם אותו מדיום עיכול. המשך בהליך זה עד שכל התאים מנותקים לחלוטין. כדי לאשר את הפיזור המלא של התאים, התבוננו בצינורות תחת מיקרוסקופ (עדשה אובייקטיבית 4x). אסוף את התאים המפוזרים באמצעות צנטריפוגה ב 150 x גרם במשך 5 דקות ונתק אותם ב 1-2 מ”ל של מאגר מודעות. מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות של קרדיומיוציטיםנתח את התאים באמצעות מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) באמצעות מסנני פסים של 556-601 ננומטר כדי לזהות אותות פלואורסצנטיים אדומים. בזהירות לבצע pre-gating כדי למנוע שברים כפולים14. הגדרות השער לסילוק כפול צריכות להיות בהתאם להוראות היצרן. הגדר את הפיזור קדימה על ציר ה-x ואת האות הפלואורסצנטי האדום על ציר ה-y. נצפו שלוש אוכלוסיות: אוכלוסייה נמוכה ביותר המכילה אריתרוציטים ותאים מתים, אוכלוסייה אמצעית המכילה שאינם קרדיומיוציטים, כולל פיברובלסטים ותאי אנדותל, ואוכלוסייה עליונה המכילה קרדיומיוציטים חדריים טהורים7. הכנת כדורי קרדיומיוציטים אדומים עם תווית פלואורסצנטיתמיין באופן סלקטיבי את cardiomyocytes, ואת הצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 150 x גרם. יש להמיס לחלוטין את כדורי התא ב-1 מ”ל של מדיום חיוני מינימלי מהונדס אלפא (alpha-MEM) המכיל 10% סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS). מדוד את ריכוז התא באמצעות המוציטומטר ודלל את תמיסת תרחיף התא ל -3,000 תאים / מ”ל עם אלפא-MEM 10% FBS. פזרו אותם לצלחות 96 בארות לא דביקות תאים (100 מיקרוליטר לבאר), לצנטריפוגה למשך 5 דקות ב-100 x גרם, ולתרבית ל-2-3 ד’ באינקובטור תרבית תאים עם 5%CO2 ב-37°C. לפני ניסויי ההזרקה, קצרו כדור קרדיומיוציטים מכל באר באמצעות שאיפה עם מדיום התרבית באמצעות פיפטה של 1,000 מיקרוליטר, ואספו אותם בצינור של 15 מ”ל. יש להכתים עם PKH26 בהתאם להוראות היצרן למעקב לאחר ההשתלה. 2. הכנות לשיטת ההזרקה האיטית הכנת תמיסת מלאי הג’לטיןשקלו את הג’לטין, המסו אותו במאגר המודעות כדי לייצר תמיסת W/V של 10% והפכו אותו לאוטוקלאב. ייצור מכשיר הזרקת תאיםתכנון כולל של המכשיר: הכינו את המכשיר שמוצג באיור 1. מערכת זו משולבת עם מנגנון קירור מזרק ומנגנון הזרקה ראשי. הכן את מנגנון ההזרקה העיקרי המתואר להלן:להזרקת כדור קרדיומיוציטים בילוד, השתמש במחט באורך 29 G, 50 מ”מ המצוידת במזרק. חברו מזרק העברת חשמל (18G, 1 מ”ל) גב אל גב באמצעות מזרק הזרקת תאים (איור 1). חבר את המחט של מזרק העברת הכוח לצינור פוליפרופילן דק עם יכולת הרחבה לומן נמוכה. לאחר מכן, חבר את הצד השני של צינור העברת החשמל למחט של אותו מזרק (18G, 1 מ”ל), והגדר אותו במשאבת מזרק. מלאו את שני מזרקי העברת החשמל והצינורות במים ללא בועות אוויר.הערה: כאשר בוכנה אחת של מזרק העברת הכוח נדחפת פנימה, הלחץ מועבר ישירות למזרק השני, והבוכנה בולטת. הגדר את מערכת קירור מזרק ההזרקה כמתואר להלן.סובב צינור נחושת (קוטר חיצוני = 1 מ”מ; קוטר פנימי = 0.3 מ”מ; עובי = 0.35 מ”מ) בחוזקה סביב החלק המכיל את התא של מזרק הזרקת התא, ומשאיר 10 מ”מ של צינור עודף בשני קצותיו. חבר את צינור הנחושת לצינורות פלסטיק גמישים. יתר על כן, חברו את הקצוות האחרים של צינורות הפלסטיק למשאבה חיצונית, מלאו את הקו במי קירור וקררו את המים על-ידי טבילת צינור הנחושת העודף בקרח כתוש (איור 1).הערה: מערכת קירור זו שומרת על תמיסת מתלה התא בצילינדר בטמפרטורה של כ- 2°C. 3. פיתוח מודל אוטם שריר הלב של חולדה על ידי חסימת עורקים כליליים מעורפלים יש להרדים חולדות עירומות זכרים עם חסר חיסוני (F344/Njcl-rnu/rnu) באוויר המכיל 3% איזופלורן. מחדירים צינורית לקנה הנשימה ומחברים אותה למכונת ההנשמה. חבר צינורית לוופורייזר איזופלורן עם בקר כדי לשמור על ריכוז איזופלורן של 3%, ובכך לשמור על הרדמה מספקת. ודא שאין תגובה לגירויי כאב. החל משחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש. תקן את הגפיים עם סרטים כירורגיים חתוכים על צלחת כירורגית מחוממת 40 מעלות צלזיוס. סובבו את גוף החולדה מימין לציר הגוף והשתמשו בבית השחי השמאלי כשדה ניתוחי. הסר את השיער בתחום הניתוח באמצעות קרם depilatory לנגב את העור עם povidone-יוד. בעזרת מספריים חדים, חותכים חתך של 1.5 ס”מ בעור ובשריר החזה הראשי. אשר את החלל הבין-קוסטלי השלישי וקרע את השרירים הבין-קוסטליים והצדר הקוסטלי באמצעות מיקרו מלקחיים עם קצוות קהים. שמור על החזה פתוח באמצעות retractor. הסר בעדינות את קרום הלב הדק עם מלקחיים. כדי לבנות מודל אוטם של הדופן הצידית של הלב, מצאו את המיקום 1 מ”מ קאודלי לקצה האטריום השמאלי כדי לזהות את העורק הכלילי האטום, העבירו תפר משי 7-0, גרפו רקמה ברוחב 2.5 מ”מ ובעומק 2.5 מ”מ מהגבי לגחון, וקשרו את הרקמה בחוזקה. לאשר קשירה מוצלחת על ידי כיווץ חלש דיסטלי מן הליגטורה. לאחר הסרה עדינה של המשענת, מניחים תפר משי 5-0 בין החלל הבין-קוסטלי השני והרביעי, וסוגרים את בית החזה. להפחית את ריכוז isoflurane ל 1%. תפרו בעדינות את השריר והעור עם משי 5-0. יש להפחית את ריכוז האיזופלורן ל-0% ולהמתין כ-5 דקות עד לתחילת נשימה ספונטנית. יש למרוח 2 מ”ג/מ”ל לידוקאין במי מלח על החתך. מתן 1 מ”ל של מלוחים באמצעות הזרקה תת עורית. יש למרוח משחה וטרינרית באופן מקומי כדי למנוע זיהומים. הסר את החולדה מצינור האינטובציה, וחזור לכלוב בעלי החיים; לאחר מכן, לגדל את החולדות בכלובים בודדים במשך שבוע אחד. לנתח את השינויים בתפקוד משאבת הלב הסיסטולית באמצעות אקוקרדיוגרפיה.הערה: תפקוד הלב יופחת עקב אוטם שריר הלב הצידי. 4. השתלת תאים מלעוריים מונחי אקו בשיטת ההזרקה האיטית יש לחמם מראש מלאי ג’לטין 10% ב-37°C צלזיוס עד שהוא הופך לנוזלי. יש לדלל 10% מלאי ג’לטין עם מאגר מודעות שחומם מראש כדי לקבל את תמיסת הג’לטין הסופית הניתנת להזרקה של 5% w/v (100 μL נדרש לכל חיה). יש להשהות 96 כדורי קרדיומיוציטים (סה”כ: 28,800 קרדיומיוציטים לבעל חיים) ב-100 מיקרוליטר של תמיסת הזרקה מחוממת מראש. לטעון את המתלה מוכן בשלב 4.3 לתוך מזרק הזרקת התא, הימנעות שאיפה של אוויר עודף. כדי למנוע בועות במזרק, החזק אותו אנכית עם המחט כלפי מעלה, הקש על המזרק ואסוף את כל הבועות ברכס העליון של המזרק.הערה: במהלך שלב זה, שימו לב שכדורי קרדיומיוציטים מתיישבים בהדרגה על חותם הגומי של הבוכנה. שמור על המיקום האנכי של המזרק, לדחוף את הבוכנה לאט, ולהשליך את הבועות ואת תמיסת תמיסת תרחיף התא העודף עד 20 μL של תרחיף התא נשאר מזרק. לדחוף את הבוכנה בזהירות במהירות קבועה, כך כדור cardiomyocyte נשאר לנוח על חותם הגומי של הבוכנה. טבלו את המזרק הסגור ישירות באמבט קרח למשך 5 דקות. מניחים מזרק מקורר במנגנון ההזרקה. תקן בחוזקה את מנגנון מזרק ההזרקה התיישב על מכשיר תנועה עדין על במת בעלי החיים באמצעות מהדק מתכוונן מיקום X-Y-Z בעבודת יד. מכשיר התנועה העדינה יכול להזיז את מיקום המחט באמצעות החלקה בכיוון x של 20 מ”מ, נדנדה בכיוון y ותנועות קידה בכיוון z. מרדימים את החולדות בקופסה אטומה מלאה באוויר המכיל 3% איזופלורן. יש לאשר את ההרדמה ללא תגובה לגירויי כאב. החל משחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש. תקן את הגפיים עם סרטי ניתוח חתוכים על צלחת הד מחוממת של 40 מעלות צלזיוס. כדי לשמור על הרדמה מספקת, ודא שהאוויר הנשאף מכיל ריכוז של כ -3% של איזופלורן. הסר את השיער בשדה ההזרקה (בקוטר 2 ס”מ) והחזה עם קרם depilatory ונגב את העור עם יוד פובידון. החל אקו-ג’ל על החזה ובדיקת הד. הניחו את בדיקת האקו קרוב לחזה לאורך צירי הגולגולת והקאודלי והתחילו לקבל אקוקרדיוגרפיה במצב B בהתאם למדריך היצרן. מקדמים את קצה מחט ההזרקה לתוך שריר הלב במבט חזיתי (איור 2 וסרטון משלים 1). כדי להפעיל את משאבת המזרק הראשית, לחץ על לחצן התחל וסובב את החוגה כדי להתאים למספר שנקבע מראש למהירות הזרקה של כ- 0.02 μL/s. יש למרוח משחה וטרינרית באופן מקומי סביב תנוחת המחט כדי למנוע זיהומים.הערה: יש לקבוע את מספר החיוג המתאים למהירות ההזרקה המיועדת באמצעות תמיסת הזרקה. לאחר ההזרקה, הסר את מחט ההזרקה באמצעות מערכת תנועה למופת. הפחיתו את ריכוז האיזופלורן ל-0% והמתינו כ-5 דקות עד שבעל החיים חוזר להכרה מספקת כדי לשמור על עצם החזה. 5. הערכת תפקוד הלב מרדימים את החולדות בקופסה אטומה מלאה באוויר המכיל 3% איזופלורן. יש לאשר את ההרדמה ללא תגובה לגירויי כאב. החל משחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש. יש למרוח קרם מחשמל לרכישת אק”ג על קצות הגפיים. תקן את הגפיים עם סרטי ניתוח חתוכים על צלחת הד מחוממת של 40 מעלות צלזיוס. השתמש במערכת ניטור פיזיולוגי כדי לזהות אק”ג וקצב לב בזמן אמת. על פי הוראות היצרן, קבע תחילה את זווית הציר הארוך באמצעות תמונת הד במצב B המציגה את קודקוד החדר השמאלי לדרכי היציאה, ולאחר מכן סובב את בדיקת ההד ב- 90° כדי לשנות לתצוגת הציר הקצר. באמצעות מערכת התנועה העדינה של הציר הקאודלי עד הרוסטרלי בלבד של שלב החיה, התאימו את תצוגת הציר הקצר לרמת השריר הפפילרי. לאחר מכן, שנה את מצב התמונה למצב M על ידי לחיצה על כפתור M-mode , והקליט סרטון במשך 5 שניות על ידי לחיצה על כפתור Cine-loop . כדי לנתח ולחשב את קיצור השברים באמצעות התוכנה, לחצו על כפתור המדידה ועל כלי קו אנכי להגדרת הממדים הפנימיים של החדר השמאלי הסיסטולי והדיאסטולי הקצה. התוכנה מחשבת באופן אוטומטי את קיצור השברים באחוזים (FS). הפחיתו את ריכוז האיזופלורן ל-0% והמתינו כ-5 דקות עד שבעל החיים חוזר להכרה מספקת כדי לשמור על עצם החזה. 6. אימונוהיסטוכימיה תקן את הגוף שעבר המתת חסד (בצע המתת חסד כמו בשלב 1.1.3) על השולחן באמצעות סרטי הניתוח החתוכים, הבלו את הלבבות, שטוף עם PBS, וטבול את הלב ב 4% paraformaldehyde / PBS. נתחו את הלבבות לשלושה חלקים, טבלו אותם ב-40% סוכרוז להגנה מפני הקפאה, הטמיעו בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) והקפיאו אותם בטמפרטורה של -80°C. חבר את רקמות ההקפאה (עובי 8 מיקרומטר) לשקופיות זכוכית מצופות אמינוסילן. לאחר ייבוש מספק באמצעות רוח לא מחוממת הנוצרת על ידי מייבש שיער כללי, יש לטבול את מגלשות הזכוכית במי מלח חוצצים בתריס המכילים 0.2% Tween-20 (TBS-T). לטבול אותם בתמיסת חסימה במשך 30 דקות ב 25 ° C. יש לשפוך 100 μL של תמיסת החסימה הראשונית המכילה נוגדנים על המגלשה, ולדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם איטום פרפין כדי לשמור על תמיסת הנוגדנים מפוזרת על הרקמה.הערה: ריכוז הנוגדנים מוצג בטבלת החומרים. הניחו את המגלשות אופקית בקופסה בעבודת יד עם לחות גבוהה תוך ניצול האדים הטבעיים מנייר רטוב למניעת אידוי. שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם TBS-T. יש לטפל עם החומר החוסם המשני המכיל נוגדנים במשך שעה אחת ב-25°C באותו אופן כמו הנוגדן הראשי. לאחר שלוש שטיפות, צפו באותות הפלואורסצנטיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומיקרוסקופ לייזר קונפוקלי.הערה: ריכוז הנוגדנים מוצג בטבלת החומרים. ניתוח סטטיסטי: לצורך השוואת נפח התא, כפי שמוצג באיור 3A, בצעו בדיקת t לא זוגית; כדי להעריך את ההתאוששות התפקודית של הלב לאחר מתן קרדיומיוציטים באמצעות שיטת ההזרקה האיטית, כפי שמוצג באיור 4A, השתמש במבחן T זוגי. בעבודה זו, הבדלים נחשבו מובהקים סטטיסטית ב – P < 0.01. קווי שגיאה מייצגים את סטיית התקן.