Un nuevo método de inyección celular con una invasión mínima

Los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices éticas de la Universidad de Medicina de Kansai para experimentos con animales y fueron aprobados por los comités de ética (número de aprobación: 23-104). Todos los animales fueron criados bajo un ciclo constante de luz-oscuridad en un ambiente específico libre de patógenos. Todas las herramientas quirúrgicas esterilizadas, como tijeras, fórceps y retractores, se esterilizaron en autoclave y se secaron completamente. 1. Preparación de las bolas de cardiomiocitos de rata neonatal Colección de corazón de rata neonatalPara la extracción del corazón, se debe seguir un procedimiento similar al descrito en un informe anterior7. Sumergir secuencialmente a las ratas Sprague-Dawley (SD) neonatales (0-2 días después del nacimiento) en soluciones de povidona yodada y etanol al 70%, y luego transferirlas a un estuche hermético lleno de isoflurano vaporizado (la concentración debe ser superior al 10% v/v) para anestesia profunda. Después de la confirmación de la inconsciencia por una pérdida de actividad locomotora, decapitar a la rata mientras sostiene el cuerpo desde la espalda con la mano, y luego cortar 2-4 mm de tejido desde el centro frontal de la caja torácica hasta la caudal y luego en dirección rostral con tijeras afiladas. Agarra la piel de la espalda para abrir el corte y empujar el corazón hacia afuera de la caja torácica. Cortar los ventrículos con unas tijeras y sumergirlos en solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin calcio ni magnesio (PBS(−)). Dispersión de los cardiomiocitos de ratas neonatasPicar los ventrículos recolectados dispersos en una cantidad mínima de tampón Ads (tampón Ads: 116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 12,5 mM NaH2PO 4, 5,6 mM glucosa, 5,4 mM KCl, 0,8 mM MgSO4, pH 7,35) en una cristalería cóncava esterilizada en autoclave en trozos pequeños (1 mm x 1 mm) con unas tijeras curvas. Transfiera los tejidos picados y un agitador micromagnético a un tubo de centrifugación de 50 ml y disperse los tejidos en células individuales con colagenasa al 0,1 %, tripsina al 0,1 %, 20 μg/ml de DNasa I y éster metílico de tetrametilrodamina de 50 nM en tampón Ads a 37 °C agitando durante 30 min. Separe los agregados y las células dispersas a través de la sedimentación natural, recoja solo las células dispersas en un tubo y digiera los agregados celulares residuales nuevamente con el mismo medio de digestión. Continúe este procedimiento hasta que todas las células estén completamente disociadas. Para confirmar la dispersión completa de las células, observe los tubos bajo un microscopio (lente de objetivo 4x). Recoja las células dispersas mediante centrifugación a 150 x g durante 5 min y disocie en 1-2 mL de tampón Ads. Clasificación celular activada por fluorescencia de cardiomiocitosAnalice las células mediante la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) utilizando filtros de paso de banda de 556-601 nm para detectar señales de fluorescencia roja. Realice cuidadosamente la pre-compuerta para eliminar las fracciones dobletes14. La configuración de la puerta para la eliminación de dobletes debe ser según las instrucciones del fabricante. Establezca la dispersión hacia adelante en el eje x y la señal de fluorescencia roja en el eje y. Se observaron tres poblaciones: una población inferior que contenía eritrocitos y células muertas, una población media que contenía no cardiomiocitos, incluyendo fibroblastos y células endoteliales, y una población superior que contenía cardiomiocitos ventriculares puros7. Preparación de bolas de cardiomiocitos marcadas con fluorescencia rojaClasificar selectivamente los cardiomiocitos y centrifugar durante 5 min a 150 x g. Disolver completamente los gránulos celulares en 1 ml de medio esencial mínimo alfa modificado (alfa-MEM) que contenga un 10% de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor. Mida la concentración celular con un hemocitómetro y diluya la solución de suspensión celular a 3.000 células/ml con alfa-MEM 10% FBS. Distribuirlos en placas celulares no adhesivas de 96 pocillos (100 μL por pocillo), centrifugar durante 5 min a 100 x g y cultivar durante 2-3 d en una incubadora de cultivo celular con 5% de CO2 a 37 °C. Antes de los experimentos de inyección, extraiga una bola de cardiomiocitos de cada pocillo mediante aspiración con el medio de cultivo utilizando una pipeta de 1.000 μL y recójalos en un tubo de 15 ml. Tiñir con PKH26 siguiendo las instrucciones del fabricante para el seguimiento después del injerto. 2. Preparaciones para el método de inyección lenta Preparación de la solución madre de gelatinaPesa la gelatina, disuélvela en tampón Ads para producir una solución al 10% p/v y autofócala en autoclave. Producción de un dispositivo de inyección celularDiseño general del dispositivo: Prepare el aparato que se muestra en la Figura 1. Este sistema se combina con un aparato de enfriamiento de jeringa y un aparato de inyección principal. Prepare el aparato de inyección principal que se describe a continuación:Para una inyección neonatal en bola de cardiomiocitos, utilice una aguja de 29 G y 50 mm de largo equipada con una jeringa. Conecte una jeringa de transferencia de energía (18 G, 1 ml) espalda con espalda con una jeringa de inyección celular (Figura 1). Conecte la aguja de la jeringa de transferencia de potencia a un tubo delgado de polipropileno con baja capacidad de expansión de lúmenes. Luego, conecte el otro lado del tubo de transferencia de energía a la aguja de la misma jeringa (18 G, 1 ml) y colóquelo en una bomba de jeringa. Llene las dos jeringas y tubos de transferencia de energía con agua sin burbujas de aire.NOTA: Cuando se empuja un émbolo de la jeringa de transferencia de potencia, la presión se transfiere directamente a la otra jeringa y el émbolo sobresale. Configure el sistema de enfriamiento de la jeringa de inyección como se describe a continuación.Enrolle un tubo de cobre (diámetro externo = 1 mm; diámetro interno = 0,3 mm; grosor = 0,35 mm) firmemente alrededor de la parte de la jeringa de inyección celular que contiene la celda, dejando 10 mm de tubo sobrante en ambos extremos. Conecte el tubo de cobre a un tubo de plástico flexible. Además, conecte los otros extremos de la tubería de plástico a una bomba externa, llene la línea con agua de enfriamiento y enfríe el agua sumergiendo el exceso de tubo de cobre en hielo picado (Figura 1).NOTA: Este sistema de enfriamiento mantiene la solución de suspensión de celdas en el cilindro a aproximadamente 2 °C. 3. Desarrollo de un modelo de infarto de miocardio en ratas por oclusión obtusa de la arteria coronaria Anestesiar ratas desnudas macho inmunodeficientes (F344/Njcl-rnu/rnu) con aire que contenga 3% de isoflurano. Inserte una cánula en la tráquea y conéctela al respirador. Conecte una cánula a un vaporizador de isoflurano con un controlador para mantener una concentración de isoflurano del 3% y, por lo tanto, mantener suficiente anestesia. Confirmar que no hay respuesta a los estímulos de dolor. Aplique ungüento veterinario en los ojos para prevenir la sequedad. Fije las extremidades con cintas quirúrgicas cortadas en una placa quirúrgica calentada a 40 °C. Gira el cuerpo de la rata hacia la derecha del eje del cuerpo y usa la axila izquierda como campo quirúrgico. Eliminar el vello en el campo quirúrgico con una crema depilatoria y limpiar la piel con povidona yodada. Con unas tijeras afiladas, haga una incisión de 1,5 cm en la piel y el músculo pectoral mayor. Confirme el tercer espacio intercostal y rasgue los músculos intercostales y la pleura costal con micropinzas con puntas romas. Mantenga el cofre abierto usando un retractor. Retire suavemente el pericardio delgado con unas pinzas. Para construir un modelo de infarto de la pared lateral del corazón, encuentre la posición 1 mm caudal a la punta de la aurícula izquierda para identificar la arteria coronaria obtusa, pase una sutura de seda 7-0, recoja tejido de 2,5 mm de ancho y 2,5 mm de profundidad desde la dorsal hasta la ventral, y lige el tejido con fuerza. Confirme el éxito de la ligadura por la débil contracción distal de la ligadura. Después de retirar suavemente el retractor, coloque una sutura de seda 5-0 entre el segundo y el cuarto espacio intercostal, y cierre la toracotomía. Disminuya la concentración de isoflurano al 1%. Suturar suavemente el músculo y la piel con seda 5-0. Disminuya la concentración de isoflurano al 0% y espere aproximadamente 5 minutos hasta que comience la respiración espontánea. Aplique tópicamente 2 mg/ml de lidocaína en solución salina a la incisión. Administrar 1 ml de solución salina mediante una inyección subcutánea. Aplique ungüento veterinario por vía tópica para prevenir infecciones. Retire a la rata del tubo de intubación y devuélvala a la jaula del animal; Luego, cría a las ratas en jaulas individuales durante 1 semana. Analizar los cambios en la función de la bomba sistólica cardíaca mediante ecocardiografía.NOTA: La función cardíaca se verá reducida debido al infarto lateral de miocardio. 4. Trasplante percutáneo de células ecoguiado mediante el método de inyección lenta Precalentar el caldo de gelatina al 10% a 37 °C hasta que se vuelva líquido. Diluir el caldo de gelatina al 10% con tampón Ads precalentado para obtener la solución de gelatina inyectable final al 5% p/v (se requieren 100 μL por animal). Suspender 96 bolas de cardiomiocitos (total: 28.800 cardiomiocitos/animal) en 100 μL de solución inyectable precalentada. Cargue la suspensión preparada en el paso 4.3 en la jeringa de inyección celular, evitando la aspiración del exceso de aire. Para eliminar las burbujas en la jeringa, sujétela verticalmente con la aguja hacia arriba, golpee la jeringa y recoja las burbujas en la cresta superior de la jeringa.NOTA: Durante este paso, observe cómo las bolas de cardiomiocitos se asientan gradualmente en el sello de goma del émbolo. Mantenga la posición vertical de la jeringa, empuje el émbolo hacia arriba lentamente y deseche las burbujas y el exceso de solución de suspensión celular hasta que queden 20 μL de la suspensión celular en la jeringa. Empuje el émbolo con cuidado a una velocidad constante para que la bola de cardiomiocitos permanezca apoyada en el sello de goma del émbolo. Sumerja la jeringa tapada directamente en un baño de hielo durante 5 minutos. Coloque una jeringa enfriada en el aparato de inyección. Fije firmemente el aparato de jeringa de inyección colocado en un dispositivo de movimiento fino en el escenario del animal usando una abrazadera hecha a mano ajustable en posición X-Y-Z. El dispositivo de movimiento fino puede mover la posición de la aguja utilizando el deslizamiento de 20 mm en dirección x, el balanceo en dirección y los movimientos de arco en dirección z. Anestesiar a las ratas en una caja sellada llena de aire que contiene un 3% de isoflurano. Confirmar la anestesia por no responder a los estímulos dolorosos. Aplique ungüento veterinario en los ojos para prevenir la sequedad. Fije las extremidades con cintas quirúrgicas cortadas en una placa de eco calentada a 40 °C. Para mantener suficiente anestesia, asegúrese de que el aire inhalado contenga una concentración de aproximadamente el 3% de isoflurano. Retirar el vello en el campo de inyección (2 cm de diámetro) y el pecho con crema depilatoria y limpiar la piel con povidona yodada. Aplique ecogel en el pecho y sonda de eco. Coloque la sonda de eco cerca del tórax a lo largo de los ejes craneal y caudal y comience a obtener una ecocardiografía en modo B siguiendo el manual del fabricante. Avance la punta de la aguja de inyección en el miocardio en la vista frontal (Figura 2 y Video complementario 1). Para activar la bomba de jeringa principal, presione el botón de inicio y gire el dial para ajustarlo a un número predeterminado para una velocidad de inyección de aproximadamente 0,02 μL/s. Aplique el ungüento veterinario tópicamente alrededor de la posición de punción para prevenir infecciones.NOTA: Es necesario determinar el número de marcación apropiado para la velocidad de inyección prevista utilizando una solución de inyección. Después de la inyección, retire la aguja de inyección utilizando un sistema de movimiento ejemplar. Disminuya la concentración de isoflurano al 0% y espere aproximadamente 5 minutos hasta que el animal recupere la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. 5. Evaluación de la función cardíaca Anestesiar a las ratas en una caja sellada llena de aire que contiene un 3% de isoflurano. Confirmar la anestesia por no responder a los estímulos dolorosos. Aplique ungüento veterinario en los ojos para prevenir la sequedad. Aplique crema electrizante para la adquisición de ECG en las puntas de las extremidades. Fije las extremidades con cintas quirúrgicas cortadas en una placa de eco calentada a 40 °C. Utilice un sistema de monitorización fisiológica para detectar el ECG y la frecuencia cardíaca en tiempo real. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, primero determine el ángulo del eje largo utilizando la imagen de eco en modo B que muestra el vértice del ventrículo izquierdo hasta el tracto de salida y, a continuación, gire la sonda de eco 90° para cambiar a la vista de eje corto. Usando solo el sistema de movimiento fino del eje caudal al rostral de la etapa animal, ajuste la vista del eje corto al nivel del músculo papilar. A continuación, cambie el modo de imagen al modo M pulsando el botón M-mode y grabe un vídeo durante 5 s pulsando el botón Cine-loop . Para analizar y calcular el acortamiento de la fracción con el software, presione el botón Medir y una herramienta de línea vertical para definir las dimensiones internas del ventrículo izquierdo al final de la sistólica y al final de la diastólica. El software calcula automáticamente el porcentaje de acortamiento de la fracción (FS). Disminuya la concentración de isoflurano al 0% y espere aproximadamente 5 minutos hasta que el animal recupere la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. 6. Inmunohistoquímica Fije el cuerpo eutanasiado (realice la eutanasia como en el paso 1.1.3) sobre la mesa utilizando las cintas quirúrgicas cortadas, extirpe los corazones, lávelos con PBS y sumérjalos en paraformaldehído/PBS al 4%. Diseccionar los corazones en tres secciones, sumergirlos en sacarosa al 40% para crioprotección, incrustarlos en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) y congelarlos a -80 °C. Fije los tejidos crioseccionados (8 μm de grosor) a portaobjetos de vidrio recubiertos de aminosilano. Después de un secado suficiente con viento no calentado generado por un secador de pelo general, sumerja los portaobjetos de vidrio en solución salina tamponada con tris que contenga 0,2% de Tween-20 (TBS-T). Sumérgelos en una solución de bloqueo durante 30 min a 25 °C. Vierta 100 μL de la solución bloqueante primaria que contiene anticuerpos en el portaobjetos e incube durante la noche a 4 °C con sellado de parafina para mantener la solución de anticuerpos esparcida en el tejido.NOTA: La concentración de anticuerpos se muestra en la Tabla de Materiales. Coloque los portaobjetos horizontalmente en una caja de alta humedad hecha a mano utilizando el vapor natural del papel húmedo para evitar la evaporación. Lave los portaobjetos tres veces con TBS-T. Tratar con el agente bloqueador secundario que contiene anticuerpos durante 1 h a 25 °C de la misma manera que el anticuerpo primario. Después de tres lavados, observe las señales de fluorescencia con un microscopio de fluorescencia y un microscopio láser confocal.NOTA: La concentración de anticuerpos se muestra en la Tabla de Materiales. Análisis estadístico: Para la comparación del volumen de la celda, como se muestra en la Figura 3A, realice una prueba t no apareada; Para evaluar la recuperación funcional cardíaca después de la administración de cardiomiocitos mediante el método de inyección lenta, como se muestra en la Figura 4A, utilice una prueba t pareada. En este trabajo, las diferencias se consideraron estadísticamente significativas con P < .01. Las barras de error representan la desviación estándar.