Een nieuwe celinjectiemethode met minimale invasie

De dierproeven werden uitgevoerd volgens de ethische richtlijnen voor dierproeven van de Kansai-Medical University en werden goedgekeurd door de ethische commissies (goedkeuringsnummer: 23-104). Alle dieren werden grootgebracht onder een constante licht-donkercyclus in een specifieke pathogeenvrije omgeving. Alle gesteriliseerde chirurgische instrumenten, zoals scharen, tangen en retractors, werden geautoclaveerd en grondig gedroogd. 1. Bereiding van de cardiomyocytenballen van de neonatale rat De inzameling van het neonatale rattenhartVolg voor de hartafname een procedure die vergelijkbaar is met die beschreven in een vorig rapport7. Dompel neonatale (0-2 dagen na de geboorte) Sprague-Dawley (SD) ratten achtereenvolgens onder in povidonjodium en 70% ethanoloplossingen en breng ze vervolgens over in een luchtdichte behuizing gevuld met verdampte isofluraan (de concentratie moet meer dan 10% v/v zijn) voor diepe anesthesie. Na de bevestiging van bewusteloosheid door een verlies van locomotorische activiteit, onthoofd de ratterwijl u het lichaam van achteren met de hand vasthoudt, en snijd vervolgens 2-4 mm weefsel van het frontale midden van de ribbenkast naar de caudale en vervolgens in de rostrale richting met een scherpe schaar. Pak de huid van de rug vast om de snee open te trekken en duw het hart uit de ribbenkast. Knip de ventrikels af met een schaar en dompel ze onder in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) zonder calcium of magnesium (PBS(−)). Dispersie van de cardiomyocyten van de neonatale ratHak de verzamelde ventrikels verspreid in een minimale hoeveelheid Ads-buffer (Ads-buffer: 116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 12,5 mM NaH2PO 4, 5,6 mM glucose, 5,4 mM KCl, 0,8 mM MgSO4, pH 7,35) in een geautoclaveerd concaaf glaswerk in kleine stukjes (1 mm x 1 mm) met behulp van een gebogen schaar. Breng de gehakte weefsels en een micromagnetische roerder over in een centrifugatiebuis van 50 ml en dispergeer de weefsels in afzonderlijke cellen met 0,1% collagenase, 0,1% trypsine, 20 μg/ml DNase I en 50 nM tetramethylrhodaminemethylester in Ads-buffer bij 37 °C door gedurende 30 minuten te roeren. Scheid de aggregaten en gedispergeerde cellen door natuurlijke sedimentatie, verzamel alleen de gedispergeerde cellen in een buis en verteer de resterende celaggregaten opnieuw met hetzelfde verteringsmedium. Ga door met deze procedure totdat alle cellen volledig zijn gedissocieerd. Om de volledige spreiding van de cellen te bevestigen, observeert u de buizen onder een microscoop (4x objectieflens). Verzamel de gedispergeerde cellen met behulp van centrifugatie bij 150 x g gedurende 5 minuten en dissocieer ze in 1-2 ml Ads-buffer. Fluorescentie-geactiveerde celsortering van cardiomyocytenAnalyseer de cellen met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) met behulp van 556-601 nm banddoorlaatfilters om rode fluorescentiesignalen te detecteren. Voer zorgvuldig pre-gating uit om doubletfracties te elimineren14. De poortinstellingen voor doublet-eliminatie moeten voldoen aan de instructies van de fabrikant. Stel de voorwaartse verstrooiing in op de x-as en het rode fluorescentiesignaal op de y-as. Er werden drie populaties waargenomen: een onderste populatie met erytrocyten en dode cellen, een middelste populatie met niet-cardiomyocyten, waaronder fibroblasten en endotheelcellen, en een toppopulatie met pure ventriculaire cardiomyocyten7. Bereiding van cardiomyocytenballen met rode fluorescentie-labelsSorteer de cardiomyocyten selectief en centrifugeer gedurende 5 minuten op 150 x g. Los de celpellets volledig op in 1 ml alfa-gemodificeerd minimaal essentieel medium (alfa-MEM) met 10% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS). Meet de celconcentratie met behulp van een hemocytometer en verdun de celsuspensieoplossing tot 3.000 cellen/ml met alfa-MEM 10% FBS. Verdeel ze over niet-klevende celplaten met 96 putjes (100 μl per putje), centrifugeer gedurende 5 minuten bij 100 x g en kweek gedurende 2-3 dagen in een celkweekincubator met 5% CO2 bij 37 °C. Oogst vóór de injectie-experimenten een cardiomyocytenbal uit elk putje via aspiratie met het kweekmedium met behulp van een pipet van 1.000 μL en verzamel ze in een buisje van 15 ml. Beits met PKH26 volgens de instructies van de fabrikant voor het volgen na implantatie. 2. Voorbereidingen voor de langzame injectiemethode Bereiding van de gelatinebouillonoplossingWeeg de gelatine, los deze op in de advertentiebuffer om een 10% w/v-oplossing te produceren en autoclaaf deze. Productie van een celinjectieapparaatAlgemeen ontwerp van het apparaat: Bereid het apparaat voor dat wordt weergegeven in afbeelding 1. Dit systeem wordt gecombineerd met een koelapparaat voor de injectiespuit en een hoofdinjectieapparaat. Bereid het hieronder beschreven hoofdinjectieapparaat voor:Gebruik voor een injectie met een neonatale cardiomyocytenbal een naald van 29 G en 50 mm lang die is uitgerust met een injectiespuit. Sluit een stroomoverdrachtspuit (18G, 1 ml) rug aan rug aan met behulp van een celinjectiespuit (Figuur 1). Sluit de naald van de krachtoverbrengingsspuit aan op een dunne polypropyleen buis met een lage uitbreidbaarheid van lumen. Sluit vervolgens de andere kant van de aandrijfslang aan op de naald van dezelfde spuit (18G, 1 ml) en plaats deze in een spuitpomp. Vul de twee krachtoverbrengingsspuiten en slangen met water zonder luchtbellen.OPMERKING: Wanneer een zuiger van de krachtoverbrengingsspuit wordt ingedrukt, wordt de druk direct overgebracht op de andere spuit en steekt de zuiger uit. Stel het koelsysteem van de injectiespuit in zoals hieronder beschreven.Wikkel een koperen buis (uitwendige diameter = 1 mm; inwendige diameter = 0,3 mm; dikte = 0,35 mm) strak om het celbevattende deel van de celinjectiespuit, waarbij aan beide uiteinden 10 mm overtollige buis overblijft. Sluit de koperen buis aan op flexibele plastic buizen. Sluit verder de andere uiteinden van de plastic slang aan op een externe pomp, vul de leiding met koelwater en koel het water af door de overtollige koperen buis onder te dompelen in gemalen ijs (Figuur 1).OPMERKING: Dit koelsysteem houdt de celsuspensieoplossing in de cilinder op ongeveer 2 °C. 3. Ontwikkeling van een myocardinfarctmodel bij ratten door stompe occlusie van de kransslagader Verdoof mannelijke naakte ratten met een immuundeficiëntie (F344/Njcl-rnu/rnu) met lucht die 3% isofluraan bevat. Breng een canule in de luchtpijp en sluit deze aan op het gasmasker. Sluit een canule aan op een isofluraanverdamper met een controller om een isofluraanconcentratie van 3% te behouden en zo voldoende anesthesie te behouden. Bevestig dat er niet wordt gereageerd op pijnprikkels. Breng veterinaire zalf aan op de ogen om uitdroging te voorkomen. Bevestig de ledematen met doorgesneden chirurgische tapes op een verwarmde chirurgische plaat van 40 °C. Draai het lichaam van de rat naar rechts van de lichaamsas en gebruik de linkeroksel als operatieveld. Verwijder het haar in het operatieveld met een ontharingscrème en veeg de huid af met povidonjodium. Knip met een scherpe schaar een incisie van 1,5 cm in de huid en de grote borstspier. Bevestig de derde intercostale ruimte en scheur de intercostale spieren en het borstvlies van de ribben met behulp van een micropincet met stompe uiteinden. Houd de kist open met behulp van een oprolmechanisme. Verwijder het dunne hartzakje voorzichtig met een pincet. Om een infarctmodel van de laterale wand van het hart te construeren, zoekt u de positie 1 mm caudaal ten opzichte van de punt van het linker atrium om de stompe kransslagader te identificeren, passeert u een 7-0 zijden hechting, schept u weefsel op dat 2,5 mm breed en 2,5 mm diep is van dorsaal naar ventrale en bindt u het weefsel stevig vast. Bevestig een succesvolle ligatie door de zwakke contractie distaal van de ligatuur. Nadat u het oprolmechanisme voorzichtig hebt verwijderd, plaatst u een 5-0 zijden hechting tussen de tweede en vierde intercostale ruimte en sluit u de thoracotomie. Verlaag de isofluraanconcentratie tot 1%. Hecht de spier en huid voorzichtig met 5-0 zijde. Verlaag de isofluraanconcentratie tot 0% en wacht ongeveer 5 minuten tot de spontane ademhaling begint. Breng plaatselijk 2 mg/ml lidocaïne in zoutoplossing aan op de incisie. Dien 1 ml zoutoplossing toe via een subcutane injectie. Breng plaatselijk dierenartszalf aan om infecties te voorkomen. Haal de rat uit de intubatiebuis en keer terug naar de dierenkooi; Voed de ratten vervolgens gedurende 1 week op in individuele kooien. Analyseer de veranderingen in de systolische pompfunctie van het hart met behulp van echocardiografie.OPMERKING: De hartfunctie zal verminderd zijn als gevolg van een lateraal myocardinfarct. 4. Echogeleide percutane celtransplantatie met behulp van de langzame injectiemethode Verwarm 10% gelatinebouillon voor op 37 °C tot het vloeibaar wordt. Verdun 10% gelatinebouillon met voorverwarmde Ads-buffer om de uiteindelijke injecteerbare gelatineoplossing van 5% w/v te verkrijgen (100 μL is nodig per dier). Suspendeer 96 cardiomyocytenballen (totaal: 28.800 cardiomyocyten/dier) in 100 μl voorverwarmde injectieoplossing. Laad de in stap 4.3 bereide suspensie in de injectiespuit met celinjectiespuit en vermijd het opzuigen van overtollige lucht. Om luchtbellen in de spuit te verwijderen, houdt u deze verticaal met de naald omhoog, tikt u op de spuit en verzamelt u eventuele luchtbellen aan de bovenrand van de spuit.NOTITIE: Observeer tijdens deze stap hoe de cardiomyocytenballen zich geleidelijk op de rubberen afdichting van de zuiger nestelen. Houd de verticale positie van de spuit aan, duw de zuiger langzaam omhoog en gooi de luchtbellen en overtollige celsuspensieoplossing weg totdat er 20 μL van de celsuspensie in de spuit achterblijft. Duw de plunjer voorzichtig met een constante snelheid zodat de cardiomyocytenbal op de rubberen afdichting van de plunjer blijft rusten. Dompel de spuit met dop gedurende 5 minuten direct onder in een ijsbad. Plaats een gekoelde spuit in het injectieapparaat. Bevestig het injectiespuitapparaat stevig op een fijn bewegingsapparaat op het dierenpodium met behulp van een X-Y-Z-positie verstelbare handgemaakte klem. Het fijne bewegingsapparaat kan de naaldpositie verplaatsen met behulp van de x-richting 20 mm schuif, y-richting zwaai en z-richting buigbewegingen. Verdoof de ratten in een afgesloten doos gevuld met lucht die 3% isofluraan bevat. Bevestig anesthesie door niet te reageren op pijnprikkels. Breng veterinaire zalf aan op de ogen om uitdroging te voorkomen. Bevestig de ledematen met doorgesneden chirurgische tapes op een verwarmde echoplaat van 40 °C. Om voldoende anesthesie te behouden, moet u ervoor zorgen dat de ingeademde lucht een concentratie van ongeveer 3% isofluraan bevat. Verwijder het haar op het injectieveld (2 cm in diameter) en de borst met ontharingscrème en veeg de huid af met povidonjodium. Breng echo-gel aan op de borst en echosonde. Plaats de echosonde dicht bij de borst langs de schedel- en staartas en begin met het verkrijgen van B-modus echocardiografie volgens de handleiding van de fabrikant. Steek de punt van de injectienaald in het myocardium bij het vooraanzicht (Figuur 2 en aanvullende video 1). Om de hoofdspuitpomp te activeren, drukt u op de Start-knop en draait u aan de draaiknop om een vooraf bepaald getal in te stellen voor een injectiesnelheid van ongeveer 0,02 μl/s. Breng dierenartszalf plaatselijk aan rond de naaldpositie om infecties te voorkomen.OPMERKING: Het is noodzakelijk om het juiste kiesnummer voor de beoogde injectiesnelheid te bepalen met behulp van een injectieoplossing. Verwijder na de injectie de injectienaald met behulp van een voorbeeldig bewegingssysteem. Verlaag de isofluraanconcentratie tot 0% en wacht ongeveer 5 minuten totdat het dier weer voldoende bij bewustzijn is om sternale lighouding te behouden. 5. Evaluatie van de hartfunctie Verdoof de ratten in een afgesloten doos gevuld met lucht die 3% isofluraan bevat. Bevestig anesthesie door niet te reageren op pijnprikkels. Breng veterinaire zalf aan op de ogen om uitdroging te voorkomen. Breng een elektrificerende crème aan voor ECG-acquisitie op de uiteinden van de ledematen. Bevestig de ledematen met doorgesneden chirurgische tapes op een verwarmde echoplaat van 40 °C. Gebruik een fysiologisch monitoringsysteem om real-time ECG en hartslag te detecteren. Bepaal volgens de instructies van de fabrikant eerst de hoek van de lange as met behulp van het B-modus echobeeld dat de linkerventrikeltop ten opzichte van het uitstroomkanaal laat zien, en draai vervolgens de echosonde 90° om over te schakelen naar de korte-asweergave. Gebruik alleen het fijne bewegingssysteem van de caudale naar de rostrale as van het dierlijke stadium en pas de korte-asweergave aan op het niveau van de papillaire spier. Verander vervolgens de beeldmodus in M-modus door op de M-modusknop te drukken en neem een video op gedurende 5 seconden door op de Cine-loop-knop te drukken. Om de breukverkorting te analyseren en te berekenen met behulp van de software, drukt u op de knop Meten en een verticale lijn om de eindsystolische en einddiastolische linkerventrikel interne afmetingen te definiëren. De software berekent automatisch het percentage fractieverkorting (FS). Verlaag de isofluraanconcentratie tot 0% en wacht ongeveer 5 minuten totdat het dier weer voldoende bij bewustzijn is om sternale lighouding te behouden. 6. Immunohistochemie Bevestig het geëuthanaseerde lichaam (voer euthanasie uit zoals in stap 1.1.3) op de tafel met behulp van de doorgesneden chirurgische tapes, snijd de harten weg, was met PBS en dompel het hart onder in 4% paraformaldehyde/PBS. Ontleed de harten in drie delen, dompel ze onder in 40% sucrose voor cryoprotectie, veranker ze in een optimale snijtemperatuur (OCT) compound en vries ze in bij -80 °C. Bevestig de gecryosectioneerde weefsels (8 μm dikte) op met aminosilaan gecoate glasplaatjes. Na voldoende drogen met niet-opgewarmde wind gegenereerd door een algemene föhn, dompelt u de glasglaasjes onder in tris-gebufferde zoutoplossing die 0,2% Tween-20 (TBS-T) bevat. Dompel ze onder in een blokkerende oplossing gedurende 30 minuten bij 25 °C. Giet 100 μl van de primaire antilichaambevattende blokkerende oplossing op het objectglaasje en incubeer een nacht bij 4 °C met paraffineafdichting om de antilichaamoplossing op het weefsel te verspreiden.OPMERKING: De antilichaamconcentratie wordt weergegeven in de tabel met materialen. Leg de glaasjes horizontaal in een handgemaakte doos met een hoge luchtvochtigheid en gebruik de natuurlijke damp van nat papier om verdamping te voorkomen. Was de glaasjes drie keer met TBS-T. Behandel met het secundaire antilichaambevattende blokker gedurende 1 uur bij 25 °C op dezelfde wijze als het primaire antilichaam. Observeer na drie wasbeurten de fluorescentiesignalen met behulp van een fluorescentiemicroscoop en confocale lasermicroscoop.OPMERKING: De antilichaamconcentratie wordt weergegeven in de tabel met materialen. Statistische analyse: Voer voor de vergelijking van het celvolume, zoals weergegeven in figuur 3A, een niet-gepaarde t-toets uit; om het cardiale functionele herstel na toediening van cardiomyocyten te beoordelen met behulp van de langzame injectiemethode, zoals weergegeven in figuur 4A, gebruikt u een gepaarde T-test. In dit werk werden verschillen als statistisch significant beschouwd bij P <.01. Foutbalken geven de standaarddeviatie weer.