Um novo método de injeção de células com invasão mínima

Os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes éticas para experimentos com animais da Kansai-Medical University e foram aprovados pelos comitês de ética (número de aprovação: 23-104). Todos os animais foram criados sob um ciclo claro-escuro constante em um ambiente específico livre de patógenos. Todos os instrumentos cirúrgicos esterilizados, como tesouras, pinças e afastadores, foram autoclavados e secos completamente. 1. Preparo das bolas de cardiomiócitos neonatais de ratos Coleção cardíaca neonatal de ratosPara a coleta do coração, seguir procedimento semelhante ao descrito em relato anterior7. Imergir ratos Sprague-Dawley (SD) neonatais (0-2 dias após o nascimento) em soluções de iodopovidona e etanol a 70% sequencialmente e, em seguida, transferi-los para um estojo hermético preenchido com isoflurano vaporizado (a concentração deve ser superior a 10% v/v) para anestesia profunda. Após a confirmação da inconsciência por uma perda de atividade locomotora, decapitar o rato enquanto segura o corpo das costas com a mão e, em seguida, cortar 2-4 mm de tecido do centro frontal da caixa torácica para o caudal e, em seguida, na direção rostral usando tesoura afiada. Segure a pele traseira para abrir o corte e empurrar o coração da caixa torácica. Corte os ventrículos usando tesoura e mergulhe-os em solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem cálcio ou magnésio (PBS(−)). Dispersão dos cardiomiócitos neonatais de ratosPicar os ventrículos coletados dispersos em uma quantidade mínima de buffer de Ads (buffer de Ads: NaCl 116 mM, HEPES 20 mM, 12,5 mM NaH2PO 4, 5,6 mM de glicose, 5,4 mM KCl, 0,8 mM MgSO4, pH 7,35) em um vidro côncavo autoclavado em pequenos pedaços (1 mm x 1 mm) usando tesoura curva. Transferir os tecidos picados e um agitador micromagnético para um tubo de centrifugação de 50 mL e dispersar os tecidos em células únicas com colagenase a 0,1%, tripsina a 0,1%, DNase I 20 μg/mL e éster metílico de tetrametilrodamina 50 nM em tampão Ads a 37 °C, agitando por 30 min. Separe os agregados e as células dispersas através da sedimentação natural, colete apenas as células dispersas em um tubo e digerir os agregados celulares residuais novamente com o mesmo meio de digestão. Continue este procedimento até que todas as células estejam completamente dissociadas. Para confirmar a dispersão completa das células, observe os tubos ao microscópio (lente objetiva 4x). Coletar as células dispersas usando centrifugação a 150 x g por 5 min e dissociá-las em 1-2 mL de tampão Ads. Triagem celular ativada por fluorescência de cardiomiócitosAnalise as células usando a classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) usando filtros passa-banda de 556-601 nm para detectar sinais de fluorescência vermelha. Realizar cuidadosamente o pré-confinamento para eliminar as frações duplas14. As configurações do portão para eliminação dupla devem estar de acordo com as instruções do fabricante. Defina a dispersão direta no eixo x e o sinal de fluorescência vermelho no eixo y. Três populações foram observadas: uma população mais baixa contendo eritrócitos e células mortas, uma população média contendo não-cardiomiócitos, incluindo fibroblastos e células endoteliais, e uma população superior contendo cardiomiócitos ventricularespuros7. Preparação de bolas de cardiomiócitos marcadas com fluorescência vermelhaClassificar seletivamente os cardiomiócitos e centrifugar por 5 min a 150 x g. Dissolver completamente os pellets celulares em 1 mL de meio essencial mínimo modificado alfa (alfa-MEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) inativado pelo calor. Medir a concentração celular usando um hemocitômetro e diluir a solução de suspensão celular para 3.000 células/mL com alfa-MEM 10% FBS. Distribuí-los em placas celulares não adesivas de 96 poços (100 μL por poço), centrifugar por 5 min a 100 x g e cultura para 2-3 d em incubadora de cultura celular com 5% de CO2 a 37 °C. Antes dos experimentos de injeção, colher uma bola de cardiomiócitos de cada poço por aspiração com o meio de cultura usando uma pipeta de 1.000 μL e coletá-la em um tubo de 15 mL. Coloração com PKH26 seguindo as instruções do fabricante para rastreamento após a enxertia. 2. Preparações para o método de injeção lenta Preparação da solução-mãe de gelatinaPesar a gelatina, dissolvê-la em tampão Ads para produzir uma solução a 10% p/v e autoclavá-la. Produção de um dispositivo de injeção de célulasProjeto geral do dispositivo: Prepare o aparelho mostrado na Figura 1. Este sistema é combinado com um aparelho de resfriamento de seringa e um aparelho de injeção principal. Preparar o aparelho de injeção principal descrito abaixo:Para uma injeção neonatal de bola de cardiomiócitos, use uma agulha de 29 G, 50 mm de comprimento equipada com uma seringa. Conecte uma seringa de transferência de energia (18G, 1 mL) consecutivamente usando uma seringa de injeção de células (Figura 1). Conecte a agulha da seringa de transferência de energia a um tubo fino de polipropileno com baixa capacidade de expansão do lúmen. Em seguida, conecte o outro lado do tubo de transferência de energia à agulha da mesma seringa (18G, 1 mL) e coloque-a em uma bomba de seringa. Encha as duas seringas e tubos de transferência de energia com água sem bolhas de ar.NOTA: Quando um êmbolo da seringa de transferência de energia é empurrado, a pressão é transferida diretamente para a outra seringa e o êmbolo se projeta. Configure o sistema de resfriamento da seringa de injeção conforme descrito abaixo.Enrolar firmemente um tubo de cobre (diâmetro externo = 1 mm; diâmetro interno = 0,3 mm; espessura = 0,35 mm) firmemente ao redor da parte que contém a célula da seringa de injeção celular, deixando 10 mm de excesso de tubo em ambas as extremidades. Conecte o tubo de cobre a tubos plásticos flexíveis. Além disso, conecte as outras extremidades da tubulação plástica a uma bomba externa, encha a linha com água de resfriamento e resfrie a água imergindo o excesso do tubo de cobre em gelo triturado (Figura 1).NOTA: Este sistema de arrefecimento mantém a solução de suspensão celular no cilindro a aproximadamente 2 °C. 3. Desenvolvimento de um modelo de infarto do miocárdio em ratos por oclusão obtusa da artéria coronária Anestesiar ratos machos imunodeficientes nus (F344/Njcl-rnu/rnu) com ar contendo isoflurano a 3%. Insira uma cânula na traqueia e conecte-a ao respirador. Conecte uma cânula a um vaporizador de isoflurano com um controlador para manter uma concentração de isoflurano a 3% e, assim, manter anestesia suficiente. Confirme que não houve resposta a estímulos dolorosos. Aplique pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento. Fixar os membros com fitas cirúrgicas cortadas em uma placa cirúrgica aquecida a 40 °C. Torcer o corpo do rato à direita do eixo do corpo e usar a axila esquerda como campo cirúrgico. Retire os pelos no campo cirúrgico usando um creme depilatório e limpe a pele com iodopovidona. Usando tesoura afiada, corte uma incisão de 1,5 cm na pele e no músculo peitoral maior. Confirmar o terceiro espaço intercostal e rasgar os músculos intercostais e a pleura costal usando micropinças com pontas rombas. Mantenha o peito aberto usando um afastador. Remova suavemente o pericárdio fino com pinças. Para construir um modelo de infarto da parede lateral do coração, encontrar a posição 1 mm caudal à ponta do átrio esquerdo para identificar a artéria coronária obtusa, passar uma sutura de seda 7-0, colher tecido com 2,5 mm de largura e 2,5 mm de profundidade do dorsal para ventral e ligar o tecido firmemente. Confirmar o sucesso da ligadura pela contração fraca distal da ligadura. Após a remoção suave do afastador, colocar um fio de seda 5-0 entre o segundo e o quarto espaços intercostais e fechar a toracotomia. Diminuir a concentração de isoflurano para 1%. Suture suavemente o músculo e a pele com seda 5-0. Diminuir a concentração de isoflurano para 0% e aguardar aproximadamente 5 min até que a respiração espontânea comece. Aplicar topicamente 2 mg/mL de lidocaína em soro fisiológico na incisão. Administrar 1 ml de solução salina por injeção subcutânea. Aplique pomada veterinária topicamente para prevenir infecções. Retirar o rato do tubo de intubação e retornar à gaiola do animal; Em seguida, levante os ratos em gaiolas individuais por 1 semana. Analisar as alterações na função da bomba sistólica cardíaca por meio da ecocardiografia.NOTA: A função cardíaca estará reduzida devido ao infarto do miocárdio lateral. 4. Transplante de células percutâneas ecoguiado pelo método de injeção lenta Pré-aqueça o caldo de gelatina a 10% a 37 °C até ficar líquido. Diluir o caldo de gelatina a 10% com tampão Ads pré-aquecido para obter a solução final injetável de gelatina a 5% p/v (são necessários 100 μL por animal). Suspender 96 bolas de cardiomiócitos (total: 28.800 cardiomiócitos/animal) em 100 μL de solução injetável pré-aquecida. Carregar a suspensão preparada na etapa 4.3 na seringa de injeção celular, evitando a aspiração do excesso de ar. Para eliminar bolhas na seringa, segure-a verticalmente com a agulha para cima, bata na seringa e colete quaisquer bolhas na crista superior da seringa.NOTA: Durante esta etapa, observe as bolas de cardiomiócitos gradualmente se acomodarem no selo de borracha do êmbolo. Mantenha a posição vertical da seringa, empurre o êmbolo lentamente e elimine as bolhas e o excesso de solução de suspensão celular até que 20 μL da suspensão celular permaneçam na seringa. Empurre o êmbolo cuidadosamente a uma velocidade constante para que a bola de cardiomiócito permaneça apoiada na vedação de borracha do êmbolo. Mergulhe a seringa tampada diretamente em um banho de gelo por 5 min. Coloque uma seringa resfriada no aparelho de injeção. Fixe firmemente o aparelho da seringa de injeção instalado em um dispositivo de movimento fino no palco do animal usando uma braçadeira artesanal ajustável em posição X-Y-Z. O dispositivo de movimento fino pode mover a posição da agulha usando os movimentos de deslizamento de 20 mm na direção x, balanço na direção y e curvamento na direção z. Anestesiar os ratos em uma caixa selada cheia de ar contendo isoflurano a 3%. Confirmar a anestesia sem resposta aos estímulos dolorosos. Aplique pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento. Fixar os membros com fitas cirúrgicas cortadas em uma placa de eco aquecida a 40 °C. Para manter anestesia suficiente, certifique-se de que o ar inalado contenha uma concentração de aproximadamente 3% de isoflurano. Retire o cabelo no campo de injeção (2 cm de diâmetro) e o peito com creme depilatório e limpe a pele com iodopovidona. Aplicar eco-gel no tórax e sonda de eco. Colocar o ecoprobe próximo ao tórax ao longo dos eixos cranial e caudal e iniciar a obtenção da ecocardiografia modo B seguindo o manual do fabricante. Avançar a ponta da agulha de injeção para o miocárdio na vista frontal (Figura 2 e Vídeo Suplementar 1). Para ativar a bomba de seringa principal, pressione o botão Iniciar e gire o mostrador para ajustar a um número predeterminado para uma velocidade de injeção de aproximadamente 0,02 μL/s. Aplique pomada veterinária topicamente ao redor da posição do agulhamento para evitar infecções.NOTA: É necessário determinar o número de marcação adequado para a velocidade de injeção pretendida utilizando uma solução de injeção. Após a injeção, remova a agulha de injeção usando um sistema de movimento exemplar. Diminuir a concentração de isoflurano para 0% e aguardar aproximadamente 5 min até que o animal recupere a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. 5. Avaliação da função cardíaca Anestesiar os ratos em uma caixa selada cheia de ar contendo isoflurano a 3%. Confirmar a anestesia sem resposta aos estímulos dolorosos. Aplique pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento. Aplique creme eletrizante para aquisição de ECG nas pontas dos membros. Fixar os membros com fitas cirúrgicas cortadas em uma placa de eco aquecida a 40 °C. Use um sistema de monitoramento fisiológico para detectar ECG em tempo real e frequência cardíaca. De acordo com as instruções do fabricante, primeiro determine o ângulo do eixo longo usando a imagem de eco modo B mostrando o ápice do ventrículo esquerdo para a via de saída e, em seguida, gire o ecoprobe 90° para mudar para o corte de eixo curto. Usando apenas o sistema de movimento fino do eixo caudal para rostral do estágio animal, ajuste a visão de eixo curto para o nível do músculo papilar. Em seguida, altere o modo de imagem para o modo M pressionando o botão M-mode e grave um vídeo por 5 s pressionando o botão Cine-loop. Para analisar e calcular o encurtamento da fração usando o software, pressione o botão Medir e uma ferramenta de linha vertical para definir as dimensões internas sistólicas e diastólicas finais do ventrículo esquerdo. O software calcula automaticamente a porcentagem de encurtamento da fração (FS). Diminuir a concentração de isoflurano para 0% e aguardar aproximadamente 5 min até que o animal recupere a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. 6. Imuno-histoquímica Fixar o corpo eutanasiado (realizar a eutanásia como no passo 1.1.3) sobre a mesa usando as fitas cirúrgicas cortadas, excisar os corações, lavar com PBS e imergir o coração em paraformaldeído/PBS a 4%. Disseque os corações em três seções, mergulhe-os em sacarose a 40% para crioproteção, embuta em um composto de temperatura de corte ideal (OCT) e congele-os a -80 °C. Fixar os tecidos criosseccionados (8 μm de espessura) a lâminas de vidro revestidas com aminosilano. Após secagem suficiente usando vento não aquecido gerado por um secador de cabelo geral, mergulhe as lâminas de vidro em solução salina tamponada com tris, contendo 0,2% de Tween-20 (TBS-T). Mergulhá-los numa solução de bloqueio durante 30 minutos a 25 °C. Despeje 100 μL da solução de bloqueio contendo anticorpos primários na lâmina e incube durante a noite a 4 °C com selamento em parafina para manter a solução de anticorpos espalhada no tecido.NOTA: A concentração de anticorpos é mostrada na Tabela de Materiais. Coloque as lâminas horizontalmente em uma caixa artesanal de alta umidade utilizando o vapor natural do papel molhado para evitar a evaporação. Lave as lâminas três vezes com TBS-T. Tratar com o agente bloqueador secundário contendo anticorpos durante 1 h a 25 °C da mesma forma que o anticorpo primário. Após três lavagens, observar os sinais de fluorescência utilizando microscópio de fluorescência e microscópio confocal a laser.NOTA: A concentração de anticorpos é mostrada na Tabela de Materiais. Análise estatística: Para a comparação do volume celular, como mostra a Figura 3A, realizar o teste t não pareado; para avaliar a recuperação funcional cardíaca após a administração de cardiomiócitos pelo método de injeção lenta, como mostrado na Figura 4A, use um teste t pareado. Neste trabalho, as diferenças foram consideradas estatisticamente significantes a partir de P <,01. As barras de erro representam o desvio padrão.