Mensuração da Viabilidade Embrionária e do Tamanho da Ninhada em Caenorhabditis elegans
Summary
Aqui, apresentamos um método geral para determinar a viabilidade embrionária e o número total de embriões produzidos (ninhada) usando o organismo modelo C. elegans.
Abstract
Caenorhabditis elegans é um excelente organismo modelo para o estudo da meiose, fertilização e desenvolvimento embrionário. C. elegans existem como hermafroditas autofecundantes, que produzem grandes ninhadas de progênie – quando os machos estão presentes, eles podem produzir ninhadas ainda maiores de progênie cruzada. Erros de meiose, fertilização e embriogênese podem ser rapidamente avaliados como fenótipos de esterilidade, fertilidade reduzida ou letalidade embrionária. Este artigo descreve um método para determinar a viabilidade embrionária e o tamanho da ninhada em C. elegans. Demonstramos como configurar este ensaio escolhendo um verme em uma placa individual de Youngren modificado, apenas bactopeptona (MYOB), estabelecer o período de tempo apropriado para contar progênie viável e embriões não viáveis e explicar como contar com precisão espécimes de vermes vivos. Esta técnica pode ser usada para determinar a viabilidade em hermafroditas autofertilizantes, bem como a fertilização cruzada por pares de acasalamento. Esses experimentos relativamente simples são facilmente adotáveis por novos pesquisadores, como estudantes de graduação e alunos do primeiro ano de pós-graduação.
Introduction
A reprodução sexuada em organismos eucarióticos requer a produção de gametas funcionais que se fundem para formar um embrião através do processo de fecundação. Os gametas materno e paterno, o óvulo (óvulos) e o espermatozoide são criados através dos processos especializados de divisão e diferenciação celular da meiose e gametogênese1. A meiose começa com uma única célula diploide e termina com a formação de células filhas que contêm metade do número de cromossomos da célula parental original. Desde a redução da ploidia até o embaralhamento do material genético via sortimento independente e recombinação cruzada, a meiose cumpre múltiplas funções importantes1. Erros dentro da meiose podem resultar em aneuploidia, em que há muitos ou poucos cromossomos dentro de um gameta. As incidências de aneuploidias têm enormes impactos na saúde humana, uma vez que os desequilíbrios cromossômicos são uma das principais causas de abortos espontâneos e distúrbios do desenvolvimento, como a síndrome de Down e a síndrome deEdwards2.
A fecundação é o processo pelo qual os gametas materno e paterno se fundem para gerar um novo organismo3. O reconhecimento de gametas-gametas é facilitado por proteínas na superfície do gameta3. Erros com compatibilidade de gametas levam à infertilidade, pois a fusão de espermatozoides e óvulos é incapaz de prosseguir. A fusão de espermatozoides com um ovócito desencadeia uma série de eventos que levam à formação adequada de um embrião ativo que pode iniciar a jornada de desenvolvimento de um embrião unicelular para um organismo multicelular totalmente funcional via divisões mitóticas4. Ao longo da embriogênese, os eventos moleculares que regulam o desenvolvimento devem ser rigorosamente regulados e cronometrados, para permitir o crescimento adequado do organismo5. A diferenciação celular adequada durante o desenvolvimento inicial é crucial à medida que o organismo faz a transição de um embrião pluripotente para um organismo de pleno direito. Devido às complexidades desses eventos, as rupturas podem levar a defeitos de desenvolvimento que resultam em letalidade embrionária.
Caenorhabditis elegans é um excelente organismo modelo para estudar meiose, fertilização e desenvolvimento embrionário. C. elegans é um nematódeo transparente que possui dois sexos, machos e hermafroditas. C. elegans hermafroditas, capazes de autofecundação, são o sexo predominante 6,7. A gônada hermafrodita produz espermatozoides pela primeira vez durante o quarto estágio larval (L4), que são armazenados na espermateca. Na transição de L4 para a idade adulta, a linha germinativa muda para a produção de ovócitos, que são então fertilizados através dos espermatozoides armazenados. Os machos, que surgem nos hermafroditas a uma taxa inferior a 0,2%, só produzem espermatozoides e podem acasalar com hermafroditas. Na fecundação cruzada, os espermatozoides masculinos superam os hermafroditas na fecundação dos ovócitos8. Isso permite a manutenção relativamente fácil de mutantes homozigotos através de estoques autofertilizantes e manipulações genéticas através de cruzamentos genéticos. Os dois sexos permitem estudos que exploram diferenças entre meiose em linhagens germinativas masculinas e femininas. Além disso, devido à natureza transparente de C. elegans e seus ovos, os processos de meiose, gametogênese, fertilização e embriogênese podem ser estudados em animais vivos e intactos usando técnicas de imagem por fluorescência.
Ao analisar novas mutações em genes que podem desempenhar um papel na meiose, fertilização e/ou desenvolvimento embrionário em C. elegans, um primeiro passo crucial é determinar a viabilidade embrionária e o tamanho da ninhada, uma vez que erros nesses processos frequentemente levam a uma falha ou redução na produção de progênie viável. Este trabalho descreve um protocolo para avaliar a fertilidade, a viabilidade embrionária e o tamanho da ninhada de hermafroditas autofertilizantes ou cruzamentos entre hermafroditas e machos. Embora este ensaio clássico tenha sido usado em muitos estudos de C. elegans , nós fornecemos um protocolo padronizado para configuração e quantificação precisa. Neste protocolo, vermes individuais ou pares macho/hermafrodita são isolados para permitir o acasalamento e a produção de progênies. A produção e a viabilidade de progênies são observadas ao longo de uma série de dias para determinar o número de progênies viáveis e embriões não viáveis. Ao final do experimento, as ninhadas individuais são analisadas para calcular a porcentagem de viabilidade embrionária e o tamanho total da ninhada.
Protocol
Representative Results
Discussion
A propagação de espécies reprodutoras sexuadas requer a formação de gametas haploides (isto é, óvulos e espermatozoides) através da meiose, que são então unificados na fecundação, restaurando o número cromossômico diploide e iniciando o desenvolvimento embrionário. Erros em qualquer um desses processos podem levar à infertilidade, letalidade embrionária e/ou defeitos congênitos. C. elegans é um poderoso sistema modelo para estudar a reprodução sexuada. Os efeitos de mutações gênicas ou knockdown de expressão gênica (por exemplo, interferência de RNA) podem ser avaliados de forma relativamente rápida e fácil usando os ensaios de viabilidade embrionária e dimensionamento de ninhada descritos acima. Utilizamos esses métodos para a caracterização inicial de genes envolvidos na segregação cromossômica meiótica e fertilização/ativação de ovos10,11,12. Uma redução observada na viabilidade embrionária ou no tamanho da ninhada indica uma interrupção na meiose, gametogênese, fertilização ou embriogênese.
Como a viabilidade embrionária e o dimensionamento da ninhada são avaliados com relativa facilidade por meio da contagem de progênie e de um cálculo matemático simples, esses são experimentos introdutórios ideais para iniciantes em pesquisa, seja no laboratório ou na sala de aula. A facilidade de criação de C. elegans e as vantagens econômicas os tornam particularmente adequados para aulas de biologia experimental. Os alunos adquirem valiosa experiência de pesquisa através da criação de C. elegans , aprendem a usar microscópios dissecantes e podem fazer perguntas biológicas em um sistema de desenvolvimento que podem ser respondidas em um período relativamente curto de tempo (aproximadamente 5 dias com o protocolo descrito neste artigo).
O momento da contagem de progênies é muito importante para ensaios de viabilidade embrionária. A 20 °C, a embriogênese leva aproximadamente 16 h, e adultos reprodutivamente maduros começam a colocar ovos aproximadamente 60 h após a eclosão como larvas L1. Como o ciclo de vida é rápido, é importante contar a progênie dentro da janela apropriada, dando tempo suficiente para que os embriões eclodam, mas antes que a própria progênie comece a colocar ovos. Também é importante notar que os períodos de crescimento variam dependendo da temperatura. O crescimento é aproximadamente 2,1 vezes mais rápido a 24-25 °C do que 15-16 °C, e aproximadamente 1,3 vezes mais rápido a 20 °C do que 15-16 °C13. Neste protocolo, recomendamos que as contagens ocorram 48 h após os adultos serem colocados em um prato fresco. Esse prazo garante que todos os embriões com desenvolvimento selvagem tenham tempo suficiente para eclodir (>16 h), mas não envelheçam até o ponto de capacidade reprodutiva. Ensaios realizados em temperaturas inferiores a 20 °C podem precisar ser estendidos (animais de transferência por 4 dias) para que os embriões eclodam e para que a progênie eclodida atinja estágios larvais mais fáceis de observar entre as bactérias nas placas MYOB (estágios L3-L4).
Uma limitação aos ensaios de viabilidade embrionária e ao dimensionamento das ninhadas é que o processo específico de desenvolvimento que é perturbado não é facilmente aparente. No entanto, esses ensaios iniciais podem ser acompanhados com técnicas citológicas para determinar qual processo é afetado. Por exemplo, a dissecção dos vermes adultos para liberar a gônada seguida pela coloração de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e a análise cuidadosa da morfologia do DNA dentro da linha germinativa podem revelar se os processos meióticos são interrompidos. Além disso, a coloração DAPI de embriões pode revelar em que estágio a embriogênese é interrompida.
Em conclusão, descrevemos um protocolo para determinar o número de embriões produzidos (ninhada) e a porcentagem de embriões viáveis para vários mutantes de C. elegans. Este ensaio pode ser usado tanto para hermafroditas autofertilizantes quanto para cruzamentos macho/hermafrodita. Com o curto ciclo de vida de C. elegans, este protocolo pode ser completado em menos de 1 semana. Ensaios de viabilidade embrionária e tamanhos de ninhada podem ser usados como primeiras análises de genes envolvidos em meiose, fertilização ou desenvolvimento embrionário, e são protocolos apropriados para pesquisadores mais avançados e novatos em pesquisa (estudantes de graduação e do primeiro ano de pós-graduação).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho no laboratório Jaramillo-Lambert é apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde NIGMS R35GM142524. Todas as cepas de C. elegans foram fornecidas pelo Centro de Genética de Caenorhabditis , que é financiado pelo National Institutes of Health, P40 OD010440. A Figura 1D foi criada usando Biorender.com.
Materials
| Materials | |||
| 35 mm Petri dishes | Tritech research | T3501 | Semi-stackable, non-vented. |
| Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For MYOB |
| Bacto-Peptone | Gibco | 211677 | For MYOB |
| Cholestrol | Sigma | C8503 | For MYOB |
| Sodium Chloride | J.T. Baker | FW 58.440 | For MYOB |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | For MYOB |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253 | For MYOB |
| Strains | |||
| C. elegans wild type strain | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | |
| Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| him-5(e1490) | Caenorhabditis Genetics Center | DR466 | |
| spo-11(ok79) | Caenorhabditis Genetics Center | AV106 | |
| Equipment/software | |||
| Differential cell counter | Fischer Scientific | 02-670-12 | |
| MicroSoft Excel or Prism | MicroSoft or GraphPad | For recording and creating graphical representations of data. | |
| platinum wire | Tritech research | PT9901 | For making worm picks. 99.5% Platinum, 0.5% Iridium. This comes as 3 ft/pack, which is sufficient for making 36 worm picks (~1 inch platinum wire per pick). |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | Diascopic base with focus mount, integrated LED module, power cord, 6.7x to 50x Zoom range [WD 115 mm], Widefield Eyepiece C-15x/17 (Note: equivalent stereomicroscopes are available from other manufacturers.) |
| worm pick handle | Tritech research | TWPH1 | For making worm picks. Mount ~1 in platinum wire into worm pick handle. Alternatively, worm picks can be made by mounting platinum wire in a glass Pasteur pipette. |
References
- Hillers, K., Jantsch, V., Martinez-Perez, E., Yanowitz, J. Meiosis. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , (2017).
- O’Connor, C. Chromosomal abnormalities: aneuploidies. Nature Education. 1 (1), 172 (2008).
- Marcello, M. R., Singaravelu, G., Fertilization Singson, A. Fertilization. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 321-350 (2013).
- Marcello, M. R., Singson, A. Fertilization and the oocyte-to-embryo transition in C. elegans. BMB Reports. 43 (6), 389-399 (2010).
- Robertson, S., Lin, R. The oocyte-to-embryo transition. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 351-372 (2013).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-31 (2015).
- Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. Nondisjunction mutants of the nematode CAENORHABDITIS ELEGANS. Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).
- Chu, D. S., Shakes, D. C. Spermatogenesis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 171-203 (2013).
- Dernburg, A. F., et al. Meiotic recombination in C. elegans initiates by a conserved mechanism and is dispensable for homologous chromosome synapsis. Cell. 94 (3), 387-398 (1998).
- Bhandari, N., et al. Identification of suppressors of top-2 embryonic lethality in Caenorhabditis elegans. G3. 3 (4), 1183-1191 (2020).
- Jaramillo-Lambert, A., Fabritius, A. S., Hansen, T. J., Smith, H. E., Golden, A. The identification of a novel mutant allele of topoisomerase II in Caenorhabditis elegans reveals a unique role in chromosome segregation during spermatogenesis. Genetics. 204 (4), 1407-1422 (2016).
- Jaramillo-Lambert, A., Golden, A. The C-terminus of SPE-11 is required for proper embryonic development in C. elegans. microPublication Biology. , (2020).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).
