מדידת כדאיות עוברית וגודל הברוד ב- Caenorhabditis elegans
Summary
כאן, אנו מציגים שיטה כללית לקביעת הכדאיות העוברית והמספר הכולל של עוברים המיוצרים (brood) באמצעות אורגניזם המודל C. elegans.
Abstract
Caenorhabditis elegans הוא אורגניזם מודל מצוין לחקר מיוזה, הפריה והתפתחות עוברית. C. elegans קיימים כהרמפרודיטים המפרים את עצמם, אשר מייצרים צאצאים גדולים – כאשר הזכרים נוכחים, הם יכולים לייצר צאצאים גדולים עוד יותר של צאצאים צולבים. טעויות במיוזה, הפריה ואמבריוגנזה ניתנות להערכה מהירה כפנוטיפים של עקרות, פוריות מופחתת או קטלניות עוברית. מאמר זה מתאר שיטה לקביעת הכדאיות העוברית וגודל הברוד ב- C. elegans. אנו מדגימים כיצד להגדיר בדיקה זו על ידי בחירת תולעת על לוחית בודדת של צעירים מעובדים, רק Bacto-peptone (MYOB), קובעים את מסגרת הזמן המתאימה לספירת צאצאים בני קיימא ועוברים שאינם בני קיימא, ומסבירים כיצד לספור במדויק דגימות תולעים חיות. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לקבוע כדאיות בהפריה עצמית hermaphrodites כמו גם הפריה הדדית על ידי זוגות הזדווגות. ניסויים פשוטים יחסית אלה ניתנים לאימוץ בקלות עבור חוקרים חדשים, כגון סטודנטים לתואר ראשון וסטודנטים בשנה הראשונה לתואר שני.
Introduction
רבייה מינית באורגניזמים איקריוטים דורשת ייצור של גמטות פונקציונליות המתמזגות ליצירת עובר בתהליך ההפריה. הגמטות האימהיות והאבהיות, הביציות והזרע נוצרים באמצעות תהליכי חלוקת תאים מיוחדים ותהליכי התמיינות של מיוזה וגמטוגנזה1. מיוזה מתחילה בתא דיפלואידי יחיד ומסתיימת בהיווצרות תאי בת המכילים מחצית ממספר הכרומוזומים של תא ההורים המקורי. החל מהפחתת פלואידיות ועד לדשדוש של חומר גנטי באמצעות מבחר עצמאי ורקומבינציה מוצלבת, מיוזה ממלאת מספר פונקציות חשובות1. טעויות בתוך מיוזה יכולות לגרום לאנאופלואידיה, שבה יש יותר מדי או מעט מדי כרומוזומים בתוך גמטה. למקרים של אנופלואידיה יש השפעות עצומות על בריאות האדם, שכן חוסר איזון כרומוזומלי הוא הגורם העיקרי להפלות והפרעות התפתחותיות כגון תסמונת דאון ותסמונת אדוארדס2.
הפריה היא התהליך שבו הגמטות האימהיות והאבהיות מתמזגות ליצירת אורגניזם חדש3. זיהוי Gamete-gamete הוא הקל על ידי חלבונים על פני הגמטה3. שגיאות בתאימות הגמטה מובילות לאי פוריות מכיוון שאיחוי זרע וביצית אינו מסוגל להמשיך. איחוי זרע עם ביצית מעורר שורה של אירועים המובילים להיווצרות נכונה של עובר פעיל שיכול להתחיל את המסע ההתפתחותי מעובר חד תאי לאורגניזם רב-תאי המתפקד במלואו באמצעות חלוקות מיטוטיות4. במהלך האמבריוגנזה, אירועים מולקולריים המווסתים את ההתפתחות חייבים להיות מוסדרים היטב ומתוזמנים במדויק כדי לאפשר צמיחה תקינה של האורגניזם5. התמיינות תאית נכונה במהלך ההתפתחות המוקדמת היא חיונית כאשר האורגניזם עובר מעובר פלוריפוטנטי לאורגניזם מלא. בשל מורכבותם של אירועים אלה, שיבושים עלולים להוביל למומים התפתחותיים הגורמים לקטלניות עוברית.
Caenorhabditis elegans הוא אורגניזם מודל מצוין לחקר מיוזה, הפריה והתפתחות עוברית. C. elegans היא נמטודה שקופה בעלת שני מינים, זכרים והרמפרודיטים. C. elegans hermaphrodites, אשר מסוגלים להפריה עצמית, הם המין השולט 6,7. הגונד ההרמפרודיטי מייצר לראשונה זרע בשלב הזחל הרביעי (L4), המאוחסנים בזרעונים. במעבר L4 לבגרות, קו הנבט עובר לייצור ביציות, אשר מופרות לאחר מכן באמצעות הזרע המאוחסן. זכרים, אשר מתעוררים hermaphrodites בשיעור של פחות מ 0.2%, רק לייצר זרע יכול להזדווג עם hermaphrodites. בהפריה צולבת, הזרע הגברי עולה על הזרע ההרמפרודיטי בהפריית הביציות8. זה מאפשר תחזוקה קלה יחסית של מוטנטים הומוזיגוטיים באמצעות מניות הפריה עצמית ומניפולציות גנטיות באמצעות הצלבות גנטיות. שני המינים מאפשרים מחקרים הבוחנים הבדלים בין מיוזה בקווי נבט זכריים ונקביים. יתר על כן, בשל האופי השקוף של C. elegans וביציותיו, ניתן לחקור את תהליכי המיוזה, הגמטוגנזה, ההפריה והאמבריוגנזה בבעלי חיים חיים ושלמים באמצעות טכניקות הדמיה פלואורסצנטית.
כאשר מנתחים מוטציות חדשות בגנים שעשויות לשחק תפקיד במיוזה, הפריה ו / או התפתחות עוברית ב- C. elegans, צעד ראשון מכריע הוא קביעת הכדאיות העוברית וגודל הצאצא, שכן טעויות בתהליכים אלה מובילות לעתים קרובות לכישלון או לירידה בייצור צאצאים בני קיימא. מאמר זה מתאר פרוטוקול להערכת פוריות, כדאיות העובר וגודל הרבייה מהרמפרודיטים המפרים את עצמם או מהכלאות בין הרמפרודיטים לזכרים. בעוד שבדיקה קלאסית זו שימשה במחקרים רבים של C. elegans , אנו מספקים פרוטוקול סטנדרטי להתקנה וכימות מדויק. בפרוטוקול זה, תולעים בודדות או זוגות זכרים/הרמפרודיטים מבודדים כדי לאפשר הזדווגות ויצירת צאצאים. ייצור צאצאים ויכולת קיום נצפים במשך סדרה של ימים כדי לקבוע את מספר הצאצאים ברי קיימא ועוברים שאינם בני קיימא. בסיום הניסוי מנתחים גזעים בודדים כדי לחשב את אחוז הכדאיות העוברית ואת גודל הברוד הכולל.
Protocol
Representative Results
Discussion
ריבוי מינים המתרבים מינית דורש היווצרות של גמטות הפלואידים (כלומר, ביציות וזרע) באמצעות מיוזה, אשר לאחר מכן מאוחדים בעת ההפריה, שחזור מספר הכרומוזום הדיפלואידי והתחלת התפתחות עוברית. טעויות בכל אחד מהתהליכים הללו עלולות להוביל לאי פוריות, קטלניות עוברית ו / או מומים מולדים. C. elegans היא מערכת מודל רבת עוצמה לחקר רבייה מינית. ניתן להעריך את ההשפעות של מוטציות גנטיות או הפלת ביטוי גנים (למשל, הפרעות RNA) במהירות ובקלות יחסית באמצעות מבחני הכדאיות העוברית ומבחני גודל הברוד שתוארו לעיל. השתמשנו בשיטות אלה לאפיון ראשוני של גנים המעורבים בהפרדת כרומוזומים מיוטיים והפריה/הפעלת ביציות10,11,12. ירידה שנצפתה בכדאיות העוברית או בגודל הברוד מצביעה על הפרעה במיוזה, בגמטוגנזה, בהפריה או באמבריוגנזה.
מכיוון שהכדאיות העוברית וגודל הצאצא מוערכים בקלות יחסית באמצעות ספירת צאצאים וחישוב מתמטי פשוט, אלה הם ניסויי מבוא אופטימליים לטירוני מחקר במעבדה או בכיתה. קלות הגידול של C. elegans והיתרונות הכלכליים הופכים אותם למתאימים במיוחד לשיעורי ביולוגיה ניסויית. הסטודנטים צוברים ניסיון מחקרי רב ערך באמצעות גידול C. elegans , לומדים להשתמש במיקרוסקופים מנתחים, ויכולים לשאול שאלות ביולוגיות במערכת התפתחותית שניתן לענות עליהן בזמן קצר יחסית (כ -5 ימים עם הפרוטוקול המתואר במאמר זה).
העיתוי של ספירת הצאצאים חשוב מאוד לבדיקות כדאיות עוברית. ב 20 ° C, embryogenesis לוקח בערך 16 שעות, ובוגרים רבייה מתחילים להטיל ביצים כ 60 שעות לאחר בקיעה כמו זחלי L1. מכיוון שמחזור החיים מהיר, חשוב לספור את הצאצאים בחלון המתאים, מה שמאפשר מספיק זמן לעוברים לבקוע אך לפני שהצאצאים עצמם מתחילים להטיל ביצים. חשוב גם לציין כי תקופות הצמיחה משתנות בהתאם לטמפרטורה. הצמיחה היא בערך 2.1 פעמים מהר יותר ב 24-25 ° C מאשר 15-16 ° C, וכ 1.3 פעמים מהר יותר ב 20 ° C מאשר 15-16 ° C13. בפרוטוקול זה, אנו ממליצים שהספירה תתרחש 48 שעות לאחר שהמבוגרים מונחים על צלחת טרייה. מסגרת זמן זו מבטיחה כי לכל העוברים עם התפתחות מסוג בר יש מספיק זמן לבקוע (>16 שעות), אך הם אינם מזדקנים עד לנקודת יכולת הרבייה. ייתכן שיהיה צורך להאריך בדיקות המבוצעות בטמפרטורות נמוכות מ-20 מעלות צלזיוס (להעביר בעלי חיים למשך 4 ימים) כדי שהעוברים יבקעו וכדי שצאצאים שבקעו יגיעו לשלבי זחל שקל יותר לצפות בהם בקרב החיידקים על לוחות MYOB (שלבי L3-L4).
מגבלה במבחני הכדאיות העוברית ובגודל הברוד היא שהתהליך ההתפתחותי הספציפי שמוטרד אינו נראה לעין. עם זאת, בדיקות ראשוניות אלה ניתן לעקוב עם טכניקות ציטולוגיות כדי לקבוע איזה תהליך מושפע. לדוגמה, דיסקציה של התולעים הבוגרות כדי לשחרר את הגונד ואחריה צביעה של 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) וניתוח זהיר של מורפולוגיה של DNA בתוך קו הנבט יכולים לגלות אם תהליכים מיוטיים משובשים. בנוסף, צביעת DAPI של עוברים יכולה לחשוף באיזה שלב אמבריוגנזה נעצרת.
לסיכום, תיארנו פרוטוקול להערכת מספר העוברים המיוצרים (brood) ואחוז העוברים שהם ברי קיימא עבור מוטציות שונות של C. elegans. בדיקה זו יכולה לשמש הן להרמפרודיטים המפרים את עצמם והן לצלבים זכריים/הרמפרודיטים. עם מחזור החיים הקצר של C. elegans, פרוטוקול זה יכול להסתיים בתוך פחות משבוע אחד. מבחני כדאיות עוברית וגדלי ברוד יכולים לשמש כאנליזות ראשונות של גנים המעורבים במיוזה, הפריה או התפתחות עוברית, והם פרוטוקולים מתאימים לחוקרים מתקדמים יותר ולטירוני מחקר (סטודנטים לתואר ראשון ושנה א’ לתואר שני) כאחד.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה במעבדת Jaramillo-Lambert נתמכת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות NIGMS R35GM142524. כל זני C. elegans סופקו על ידי המרכז לגנטיקה Caenorhabditis , הממומן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות, P40 OD010440. איור 1D נוצר באמצעות Biorender.com.
Materials
| Materials | |||
| 35 mm Petri dishes | Tritech research | T3501 | Semi-stackable, non-vented. |
| Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For MYOB |
| Bacto-Peptone | Gibco | 211677 | For MYOB |
| Cholestrol | Sigma | C8503 | For MYOB |
| Sodium Chloride | J.T. Baker | FW 58.440 | For MYOB |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | For MYOB |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253 | For MYOB |
| Strains | |||
| C. elegans wild type strain | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | |
| Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| him-5(e1490) | Caenorhabditis Genetics Center | DR466 | |
| spo-11(ok79) | Caenorhabditis Genetics Center | AV106 | |
| Equipment/software | |||
| Differential cell counter | Fischer Scientific | 02-670-12 | |
| MicroSoft Excel or Prism | MicroSoft or GraphPad | For recording and creating graphical representations of data. | |
| platinum wire | Tritech research | PT9901 | For making worm picks. 99.5% Platinum, 0.5% Iridium. This comes as 3 ft/pack, which is sufficient for making 36 worm picks (~1 inch platinum wire per pick). |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | Diascopic base with focus mount, integrated LED module, power cord, 6.7x to 50x Zoom range [WD 115 mm], Widefield Eyepiece C-15x/17 (Note: equivalent stereomicroscopes are available from other manufacturers.) |
| worm pick handle | Tritech research | TWPH1 | For making worm picks. Mount ~1 in platinum wire into worm pick handle. Alternatively, worm picks can be made by mounting platinum wire in a glass Pasteur pipette. |
References
- Hillers, K., Jantsch, V., Martinez-Perez, E., Yanowitz, J. Meiosis. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , (2017).
- O’Connor, C. Chromosomal abnormalities: aneuploidies. Nature Education. 1 (1), 172 (2008).
- Marcello, M. R., Singaravelu, G., Fertilization Singson, A. Fertilization. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 321-350 (2013).
- Marcello, M. R., Singson, A. Fertilization and the oocyte-to-embryo transition in C. elegans. BMB Reports. 43 (6), 389-399 (2010).
- Robertson, S., Lin, R. The oocyte-to-embryo transition. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 351-372 (2013).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-31 (2015).
- Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. Nondisjunction mutants of the nematode CAENORHABDITIS ELEGANS. Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).
- Chu, D. S., Shakes, D. C. Spermatogenesis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 171-203 (2013).
- Dernburg, A. F., et al. Meiotic recombination in C. elegans initiates by a conserved mechanism and is dispensable for homologous chromosome synapsis. Cell. 94 (3), 387-398 (1998).
- Bhandari, N., et al. Identification of suppressors of top-2 embryonic lethality in Caenorhabditis elegans. G3. 3 (4), 1183-1191 (2020).
- Jaramillo-Lambert, A., Fabritius, A. S., Hansen, T. J., Smith, H. E., Golden, A. The identification of a novel mutant allele of topoisomerase II in Caenorhabditis elegans reveals a unique role in chromosome segregation during spermatogenesis. Genetics. 204 (4), 1407-1422 (2016).
- Jaramillo-Lambert, A., Golden, A. The C-terminus of SPE-11 is required for proper embryonic development in C. elegans. microPublication Biology. , (2020).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).
