Misurazione della vitalità embrionale e delle dimensioni della covata in Caenorhabditis elegans
Summary
Qui, presentiamo un metodo generale per determinare la vitalità embrionale e il numero totale di embrioni prodotti (covata) utilizzando l’organismo modello C. elegans.
Abstract
Caenorhabditis elegans è un eccellente organismo modello per lo studio della meiosi, della fecondazione e dello sviluppo embrionale. I C. elegans esistono come ermafroditi autofecondanti, che producono grandi nidiate di progenie: quando sono presenti maschi, possono produrre nidiate ancora più grandi di progenie incrociata. Gli errori nella meiosi, nella fecondazione e nell’embriogenesi possono essere rapidamente valutati come fenotipi di sterilità, ridotta fertilità o letalità embrionale. Questo articolo descrive un metodo per determinare la vitalità embrionale e la dimensione della covata in C. elegans. Dimostriamo come impostare questo test scegliendo un verme su una singola piastra di Youngren modificata, solo bacto-peptone (MYOB), stabiliamo il lasso di tempo appropriato per contare la progenie vitale e gli embrioni non vitali e spieghiamo come contare accuratamente campioni di vermi vivi. Questa tecnica può essere utilizzata per determinare la vitalità negli ermafroditi autofecondanti e nella fecondazione incrociata mediante coppie di accoppiamento. Questi esperimenti relativamente semplici sono facilmente adottabili per i nuovi ricercatori, come studenti universitari e studenti laureati del primo anno.
Introduction
La riproduzione sessuale negli organismi eucarioti richiede la produzione di gameti funzionali che si fondono per formare un embrione attraverso il processo di fecondazione. I gameti materni e paterni, gli ovuli (ovuli) e gli spermatozoi vengono creati attraverso la divisione cellulare specializzata e i processi di differenziazione della meiosi e della gametogenesi1. La meiosi inizia con una singola cellula diploide e termina con la formazione di cellule figlie che contengono metà del numero di cromosomi della cellula parentale originale. Dalla riduzione della ploidia al rimescolamento del materiale genetico attraverso l’assortimento indipendente e la ricombinazione crossover, la meiosi svolge molteplici funzioni importanti1. Gli errori all’interno della meiosi possono provocare aneuploidia, in cui ci sono troppi o troppo pochi cromosomi all’interno di un gamete. L’incidenza di aneuploidie ha un enorme impatto sulla salute umana, poiché gli squilibri cromosomici sono una delle principali cause di aborti spontanei e disturbi dello sviluppo come la sindrome di Down e la sindrome di Edwards2.
La fecondazione è il processo mediante il quale i gameti materni e paterni si fondono per generare un nuovo organismo3. Il riconoscimento gamete-gamete è facilitato dalle proteine sulla superficie del gamete3. Gli errori con la compatibilità dei gameti portano alla sterilità poiché la fusione di spermatozoi e ovuli non è in grado di procedere. La fusione dello sperma con un ovocita innesca una serie di eventi che portano alla corretta formazione di un embrione attivo che può iniziare il viaggio di sviluppo da un embrione unicellulare a un organismo multicellulare completamente funzionale attraverso divisioni mitotiche4. Durante l’embriogenesi, gli eventi molecolari che regolano lo sviluppo devono essere strettamente regolati e precisamente programmati per consentire una corretta crescita dell’organismo5. Una corretta differenziazione cellulare durante lo sviluppo precoce è fondamentale quando l’organismo passa da un embrione pluripotente a un organismo a tutti gli effetti. A causa della complessità di questi eventi, le interruzioni possono portare a difetti dello sviluppo che si traducono in letalità embrionale.
Caenorhabditis elegans è un eccellente organismo modello per studiare la meiosi, la fecondazione e lo sviluppo embrionale. C. elegans è un nematode trasparente che ha due sessi, maschi ed ermafroditi. C. elegans ermafroditi, che sono capaci di autofecondazione, sono il sesso predominante 6,7. La gonade ermafrodita produce prima spermatozoi durante il quarto stadio larvale (L4), che sono immagazzinati nella spermateca. Nella transizione da L4 all’età adulta, la linea germinale passa alla produzione di ovociti, che vengono poi fecondati attraverso lo sperma immagazzinato. I maschi, che nascono negli ermafroditi ad un tasso inferiore allo 0,2%, producono solo spermatozoi e possono accoppiarsi con ermafroditi. Dopo la fecondazione incrociata, gli spermatozoi maschili superano gli spermatozoi ermafroditi nella fecondazione degli ovociti8. Ciò consente il mantenimento relativamente facile dei mutanti omozigoti attraverso ceppi autofecondanti e manipolazioni genetiche attraverso incroci genetici. I due sessi consentono studi che esplorano le differenze tra meiosi nelle linee germinali maschili e femminili. Inoltre, a causa della natura trasparente di C. elegans e delle sue uova, i processi di meiosi, gametogenesi, fecondazione ed embriogenesi possono essere studiati in animali vivi e intatti utilizzando tecniche di imaging a fluorescenza.
Quando si analizzano nuove mutazioni in geni che possono svolgere un ruolo nella meiosi, nella fecondazione e / o nello sviluppo embrionale in C. elegans, un primo passo cruciale è determinare la vitalità embrionale e le dimensioni della covata poiché gli errori in questi processi spesso portano a un fallimento o a una riduzione della produzione di progenie vitale. Questo documento descrive un protocollo per valutare la fertilità, la vitalità embrionale e le dimensioni della covata da ermafroditi autofecondanti o incroci tra ermafroditi e maschi. Mentre questo test classico è stato utilizzato in molti studi su C. elegans , forniamo un protocollo standardizzato per l’impostazione e la quantificazione accurata. In questo protocollo, singoli vermi o coppie maschio/ermafrodita sono isolati per consentire l’accoppiamento e la produzione di prole. La produzione e la vitalità della progenie vengono osservate per una serie di giorni per determinare il numero di progenie vitale e di embrioni non vitali. A conclusione dell’esperimento, le singole nidiate vengono analizzate per calcolare la percentuale di vitalità embrionale e la dimensione totale della covata.
Protocol
Representative Results
Discussion
La propagazione delle specie che si riproducono sessualmente richiede la formazione di gameti aploidi (cioè uova e spermatozoi) attraverso la meiosi, che vengono poi unificati alla fecondazione, ripristinando il numero cromosomico diploide e avviando lo sviluppo embrionale. Gli errori in uno qualsiasi di questi processi possono portare a infertilità, letalità embrionale e / o difetti alla nascita. C. elegans è un potente sistema modello per studiare la riproduzione sessuale. Gli effetti delle mutazioni geniche o del knockdown dell’espressione genica (ad esempio, interferenza dell’RNA) possono essere valutati in tempi relativamente brevi e semplici utilizzando i saggi di vitalità embrionale e dimensionamento della covata sopra descritti. Abbiamo utilizzato questi metodi per la caratterizzazione iniziale di geni coinvolti nella segregazione cromosomica meiotica e nella fecondazione/attivazione dell’uovo10,11,12. Una riduzione osservata della vitalità embrionale o delle dimensioni della covata indica un’interruzione della meiosi, della gametogenesi, della fecondazione o dell’embriogenesi.
Poiché la vitalità embrionale e il dimensionamento della covata sono valutati relativamente facilmente attraverso il conteggio della progenie e un semplice calcolo matematico, questi sono esperimenti introduttivi ottimali per i principianti della ricerca sia in laboratorio che in classe. La facilità di allevamento di C. elegans e i vantaggi economici li rendono particolarmente adatti alle lezioni di biologia sperimentale. Gli studenti acquisiscono una preziosa esperienza di ricerca attraverso l’allevamento di C. elegans , imparano a usare microscopi da dissezione e possono porre domande biologiche in un sistema di sviluppo a cui è possibile rispondere in un lasso di tempo relativamente breve (circa 5 giorni con il protocollo descritto in questo articolo).
La tempistica della conta della progenie è molto importante per i saggi di vitalità embrionale. A 20 °C, l’embriogenesi dura circa 16 ore e gli adulti maturi dal punto di vista riproduttivo iniziano a deporre le uova circa 60 ore dopo la schiusa come larve di L1. Poiché il ciclo vitale è rapido, è importante contare la progenie entro la finestra appropriata, lasciando tempo sufficiente agli embrioni per schiudersi, ma prima che la progenie stessa inizi a deporre le uova. È anche importante notare che i periodi di crescita variano a seconda della temperatura. La crescita è circa 2,1 volte più veloce a 24-25 °C che a 15-16 °C e circa 1,3 volte più veloce a 20 °C rispetto a 15-16 °C13. In questo protocollo, raccomandiamo che i conteggi avvengano 48 ore dopo che gli adulti sono stati posti su un piatto fresco. Questo lasso di tempo assicura che tutti gli embrioni con sviluppo wild-type abbiano tempo sufficiente per schiudersi (>16 ore), ma non invecchiano fino al punto di capacità riproduttiva. Può essere necessario estendere i test eseguiti a temperature inferiori a 20 °C (trasferire gli animali per 4 giorni) affinché gli embrioni si schiudano e la progenie cotta raggiunga stadi larvali più facili da osservare tra i batteri sulle piastre MYOB (stadi L3-L4).
Una limitazione ai saggi di vitalità embrionale e al dimensionamento della covata è che il processo di sviluppo specifico che è perturbato non è immediatamente evidente. Tuttavia, questi test iniziali possono essere seguiti con tecniche citologiche per determinare quale processo è interessato. Ad esempio, la dissezione dei vermi adulti per rilasciare la gonade seguita dalla colorazione 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e un’attenta analisi della morfologia del DNA all’interno della linea germinale possono rivelare se i processi meiotici sono interrotti. Inoltre, la colorazione DAPI degli embrioni può rivelare in quale fase l’embriogenesi si arresta.
In conclusione, abbiamo descritto un protocollo per misurare il numero di embrioni prodotti (covata) e la percentuale di embrioni che sono vitali per vari mutanti di C. elegans. Questo test può essere utilizzato sia per ermafroditi autofecondanti che per incroci maschio/ermafrodita. Con il breve ciclo di vita di C. elegans, questo protocollo può essere completato in meno di 1 settimana. I saggi di vitalità embrionale e le dimensioni delle covate possono essere utilizzati come prime analisi dei geni coinvolti nella meiosi, nella fecondazione o nello sviluppo embrionale e sono protocolli appropriati per ricercatori più avanzati e principianti della ricerca (studenti universitari e laureati del primo anno).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro nel laboratorio Jaramillo-Lambert è supportato dal National Institutes of Health NIGMS R35GM142524. Tutti i ceppi di C. elegans sono stati forniti dal Caenorhabditis Genetics Center, finanziato dal National Institutes of Health, P40 OD010440. La Figura 1D è stata creata utilizzando Biorender.com.
Materials
| Materials | |||
| 35 mm Petri dishes | Tritech research | T3501 | Semi-stackable, non-vented. |
| Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For MYOB |
| Bacto-Peptone | Gibco | 211677 | For MYOB |
| Cholestrol | Sigma | C8503 | For MYOB |
| Sodium Chloride | J.T. Baker | FW 58.440 | For MYOB |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | For MYOB |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253 | For MYOB |
| Strains | |||
| C. elegans wild type strain | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | |
| Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| him-5(e1490) | Caenorhabditis Genetics Center | DR466 | |
| spo-11(ok79) | Caenorhabditis Genetics Center | AV106 | |
| Equipment/software | |||
| Differential cell counter | Fischer Scientific | 02-670-12 | |
| MicroSoft Excel or Prism | MicroSoft or GraphPad | For recording and creating graphical representations of data. | |
| platinum wire | Tritech research | PT9901 | For making worm picks. 99.5% Platinum, 0.5% Iridium. This comes as 3 ft/pack, which is sufficient for making 36 worm picks (~1 inch platinum wire per pick). |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | Diascopic base with focus mount, integrated LED module, power cord, 6.7x to 50x Zoom range [WD 115 mm], Widefield Eyepiece C-15x/17 (Note: equivalent stereomicroscopes are available from other manufacturers.) |
| worm pick handle | Tritech research | TWPH1 | For making worm picks. Mount ~1 in platinum wire into worm pick handle. Alternatively, worm picks can be made by mounting platinum wire in a glass Pasteur pipette. |
References
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