Messung der Embryonalviabilität und Brutgröße bei Caenorhabditis elegans
Summary
In dieser Arbeit stellen wir eine allgemeine Methode vor, um die embryonale Lebensfähigkeit und die Gesamtzahl der produzierten Embryonen (Brut) mit dem Modellorganismus C. elegans zu bestimmen.
Abstract
Caenorhabditis elegans ist ein hervorragender Modellorganismus für die Untersuchung von Meiose, Befruchtung und Embryonalentwicklung. C. elegans existieren als selbstbefruchtende Hermaphroditen, die große Bruten von Nachkommen produzieren – wenn Männchen vorhanden sind, können sie noch größere Bruten von Kreuzungsnachkommen produzieren. Fehler in Meiose, Befruchtung und Embryogenese können schnell als Phänotypen von Sterilität, verminderter Fruchtbarkeit oder embryonaler Letalität bewertet werden. Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Bestimmung der embryonalen Lebensfähigkeit und Brutgröße bei C. elegans. Wir zeigen, wie man diesen Assay aufbaut, indem wir einen Wurm auf eine individuelle MYOB-Platte (Modified Youngren’s, Only Bacto-Pepton) setzen, den geeigneten Zeitrahmen für die Zählung lebensfähiger Nachkommen und nicht lebensfähiger Embryonen festlegen und erklären, wie man lebende Wurmproben genau zählt. Diese Technik kann sowohl zur Bestimmung der Lebensfähigkeit bei selbstbefruchtenden Hermaphroditen als auch zur Kreuzbefruchtung durch Paarungspaare verwendet werden. Diese relativ einfachen Experimente sind für neue Forscher, wie Studenten im Grundstudium und Doktoranden im ersten Jahr, leicht anwendbar.
Introduction
Die sexuelle Fortpflanzung in eukaryotischen Organismen erfordert die Produktion funktioneller Gameten, die durch den Prozess der Befruchtung zu einem Embryo verschmelzen. Mütterliche und väterliche Gameten, Eizellen und Spermien entstehen durch die spezialisierten Zellteilungs- und Differenzierungsprozesse der Meiose und Gametogenese1. Die Meiose beginnt mit einer einzelnen diploiden Zelle und endet mit der Bildung von Tochterzellen, die die Hälfte der Chromosomenzahl der ursprünglichen Elternzelle enthalten. Von der Reduktion der Ploidie bis hin zum Mischen von genetischem Material durch unabhängige Sortierung und Crossover-Rekombination erfüllt die Meiose mehrere wichtige Funktionen1. Fehler in der Meiose können zu einer Aneuploidie führen, bei der zu viele oder zu wenige Chromosomen in einer Gamete vorhanden sind. Das Auftreten von Aneuploidie hat enorme Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit, da Chromosomenungleichgewichte eine Hauptursache für Fehlgeburten und Entwicklungsstörungen wie das Down-Syndrom und das Edwards-Syndromsind 2.
Die Befruchtung ist der Prozess, bei dem die mütterlichen und väterlichen Gameten verschmelzen, um einen neuen Organismus zu erzeugen3. Die Gameten-Gameten-Erkennung wird durch Proteine auf der Gametenoberfläche erleichtert3. Fehler in der Gametenkompatibilität führen zu Unfruchtbarkeit, da die Fusion von Spermien und Eizellen nicht fortgesetzt werden kann. Die Verschmelzung von Spermien mit einer Eizelle löst eine Vielzahl von Ereignissen aus, die zur richtigen Bildung eines aktiven Embryos führen, der über mitotische Teilungen die Entwicklungsreise von einem einzelligen Embryo zu einem voll funktionsfähigen mehrzelligen Organismus beginnen kann4. Während der gesamten Embryogenese müssen molekulare Ereignisse, die die Entwicklung regulieren, streng reguliert und zeitlich genau abgestimmt werden, um ein ordnungsgemäßes Wachstum des Organismus zu ermöglichen5. Die richtige zelluläre Differenzierung während der frühen Entwicklung ist entscheidend, da der Organismus von einem pluripotenten Embryo zu einem vollwertigen Organismus übergeht. Aufgrund der Komplexität dieser Ereignisse können Störungen zu Entwicklungsstörungen führen, die zur embryonalen Letalität führen.
Caenorhabditis elegans ist ein ausgezeichneter Modellorganismus zur Untersuchung von Meiose, Befruchtung und Embryonalentwicklung. C. elegans ist ein durchsichtiger Fadenwurm, der zwei Geschlechter hat, Männchen und Hermaphroditen. C. elegans-Hermaphroditen, die zur Selbstbefruchtung fähig sind, sind das vorherrschende Geschlecht 6,7. Die hermaphroditische Keimdrüse produziert erst im vierten Larvenstadium (L4) Spermien, die in der Spermatheka gespeichert werden. Beim Übergang von L4 ins Erwachsenenalter schaltet die Keimbahn auf die Produktion von Eizellen um, die dann über die eingelagerten Spermien befruchtet werden. Männchen, die bei Hermaphroditen mit einer Rate von weniger als 0,2 % entstehen, produzieren nur Spermien und können sich mit Hermaphroditen paaren. Bei der Kreuzbefruchtung verdrängen männliche Spermien die hermaphroditischen Spermien bei der Befruchtung von Eizellen8. Dies ermöglicht die relativ einfache Haltung von homozygoten Mutanten durch selbstbefruchtende Stämme und genetische Manipulationen durch genetische Kreuzungen. Die beiden Geschlechter ermöglichen Studien, die die Unterschiede zwischen der Meiose in der männlichen und der weiblichen Keimbahn untersuchen. Darüber hinaus können aufgrund der transparenten Natur von C. elegans und seinen Eiern die Prozesse der Meiose, Gametogenese, Befruchtung und Embryogenese in lebenden, intakten Tieren mit Hilfe von Fluoreszenzbildgebungsverfahren untersucht werden.
Bei der Analyse neuer Mutationen in Genen, die bei der Meiose, Befruchtung und/oder Embryonalentwicklung von C. elegans eine Rolle spielen könnten, ist ein entscheidender erster Schritt die Bestimmung der Lebensfähigkeit des Embryos und der Brutgröße, da Fehler in diesen Prozessen oft zu einem Ausfall oder einer Verringerung der Produktion lebensfähiger Nachkommen führen. In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Beurteilung der Fruchtbarkeit, der Lebensfähigkeit des Embryos und der Brutgröße von selbstbefruchtenden Hermaphroditen oder Kreuzungen zwischen Hermaphroditen und Männchen beschrieben. Obwohl dieser klassische Assay in vielen C. elegans-Studien verwendet wurde, bieten wir ein standardisiertes Protokoll für den Aufbau und die genaue Quantifizierung an. Bei diesem Protokoll werden einzelne Würmer oder männliche/zwittrige Paare isoliert, um die Paarung und Nachkommenproduktion zu ermöglichen. Die Produktion und Lebensfähigkeit der Nachkommen wird über eine Reihe von Tagen beobachtet, um die Anzahl der lebensfähigen und nicht lebensfähigen Embryonen zu bestimmen. Am Ende des Experiments werden die einzelnen Bruten analysiert, um den Prozentsatz der embryonalen Lebensfähigkeit und die Gesamtbrutgröße zu berechnen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Vermehrung sexuell reproduzierender Arten erfordert die Bildung von haploiden Gameten (d. h. Eizellen und Spermien) durch Meiose, die dann bei der Befruchtung vereinigt werden, wodurch die diploide Chromosomenzahl wiederhergestellt und die Embryonalentwicklung eingeleitet wird. Fehler in einem dieser Prozesse können zu Unfruchtbarkeit, embryonaler Letalität und/oder Geburtsfehlern führen. C. elegans ist ein leistungsfähiges Modellsystem zur Untersuchung der sexuellen Fortpflanzung. Die Auswirkungen von Genmutationen oder Genexpressions-Knockdown (z.B. RNA-Interferenz) können mit den oben beschriebenen Embryonalviabilitäts- und Brutgrößen-Assays relativ schnell und einfach beurteilt werden. Wir haben diese Methoden für die erste Charakterisierung von Genen verwendet, die an der meiotischen Chromosomensegregation und Befruchtung/Eizellaktivierung beteiligt sind10,11,12. Eine beobachtete Verringerung der embryonalen Lebensfähigkeit oder Brutgröße deutet auf eine Störung der Meiose, Gametogenese, Befruchtung oder Embryogenese hin.
Da die Lebensfähigkeit der Embryonen und die Brutgröße durch die Zählung der Nachkommen und eine einfache mathematische Berechnung relativ einfach beurteilt werden können, sind dies optimale Einführungsexperimente für Forschungsanfänger im Labor oder im Klassenzimmer. Die einfache Haltung von C. elegans und die wirtschaftlichen Vorteile machen sie besonders geeignet für den experimentellen Biologieunterricht. Die Studierenden sammeln wertvolle Forschungserfahrung durch die Haltung von C. elegans , erlernen den Umgang mit Präpariermikroskopen und können biologische Fragestellungen in einem Entwicklungssystem stellen, die in relativ kurzer Zeit (ca. 5 Tage mit dem in dieser Arbeit beschriebenen Protokoll) beantwortet werden können.
Der Zeitpunkt der Zählung der Nachkommen ist sehr wichtig für embryonale Viabilitätstests. Bei 20 °C dauert die Embryogenese etwa 16 Stunden, und fortpflanzungsreife Erwachsene beginnen etwa 60 Stunden nach dem Schlüpfen als L1-Larven mit der Eiablage. Da der Lebenszyklus schnell ist, ist es wichtig, die Nachkommen innerhalb des entsprechenden Zeitfensters zu zählen, um genügend Zeit für das Schlüpfen der Embryonen zu haben, aber bevor die Nachkommen selbst mit der Eiablage beginnen. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Wachstumsperioden je nach Temperatur variieren. Das Wachstum ist bei 24-25 °C etwa 2,1-mal schneller als bei 15-16 °C und bei 20 °C etwa 1,3-mal schneller als bei 15-16 °C13. In diesem Protokoll empfehlen wir, dass die Zählung 48 Stunden nach dem Legen der Erwachsenen auf einen frischen Teller erfolgt. Dieser Zeitrahmen stellt sicher, dass alle Embryonen mit Wildtyp-Entwicklung genügend Zeit zum Schlüpfen haben (>16 h), aber nicht bis zur Fortpflanzungsfähigkeit altern. Assays, die bei Temperaturen unter 20 °C durchgeführt werden, müssen möglicherweise verlängert werden (Transfer der Tiere für 4 Tage), damit die Embryonen schlüpfen und die geschlüpften Nachkommen Larvenstadien erreichen, die unter den Bakterien auf den MYOB-Platten leichter zu beobachten sind (L3-L4-Stadien).
Eine Einschränkung der embryonalen Viabilitätstests und der Brutgröße besteht darin, dass der spezifische Entwicklungsprozess, der gestört wird, nicht ohne weiteres ersichtlich ist. Diese ersten Assays können jedoch mit zytologischen Techniken nachverfolgt werden, um festzustellen, welcher Prozess betroffen ist. Zum Beispiel kann die Sektion der erwachsenen Würmer zur Freisetzung der Gonade mit anschließender 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-Färbung und eine sorgfältige Analyse der DNA-Morphologie innerhalb der Keimbahn zeigen, ob meiotische Prozesse gestört sind. Darüber hinaus kann die DAPI-Färbung von Embryonen Aufschluss darüber geben, in welchem Stadium die Embryogenese zum Stillstand kommt.
Abschließend haben wir ein Protokoll beschrieben, um die Anzahl der produzierten Embryonen (Brut) und den Prozentsatz der Embryonen, die für verschiedene C. elegans-Mutanten lebensfähig sind, zu untersuchen. Dieser Assay kann sowohl für selbstbefruchtende Hermaphroditen als auch für männliche/hermaphroditische Kreuzungen verwendet werden. Mit dem kurzen Lebenszyklus von C. elegans kann dieses Protokoll in weniger als 1 Woche abgeschlossen werden. Embryonale Viabilitätstests und Brutgrößen können als erste Analysen von Genen verwendet werden, die an Meiose, Befruchtung oder Embryonalentwicklung beteiligt sind, und sind geeignete Protokolle für fortgeschrittene Forscher und Forschungsanfänger (Studenten und Doktoranden im ersten Jahr) gleichermaßen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Arbeit im Jaramillo-Lambert-Labor wird von den National Institutes of Health NIGMS R35GM142524 unterstützt. Alle C. elegans-Stämme wurden vom Caenorhabditis Genetics Center, das von den National Institutes of Health finanziert wird, P40 OD010440 zur Verfügung gestellt. Abbildung 1D wurde mit Biorender.com erstellt.
Materials
| Materials | |||
| 35 mm Petri dishes | Tritech research | T3501 | Semi-stackable, non-vented. |
| Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For MYOB |
| Bacto-Peptone | Gibco | 211677 | For MYOB |
| Cholestrol | Sigma | C8503 | For MYOB |
| Sodium Chloride | J.T. Baker | FW 58.440 | For MYOB |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | For MYOB |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253 | For MYOB |
| Strains | |||
| C. elegans wild type strain | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | |
| Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| him-5(e1490) | Caenorhabditis Genetics Center | DR466 | |
| spo-11(ok79) | Caenorhabditis Genetics Center | AV106 | |
| Equipment/software | |||
| Differential cell counter | Fischer Scientific | 02-670-12 | |
| MicroSoft Excel or Prism | MicroSoft or GraphPad | For recording and creating graphical representations of data. | |
| platinum wire | Tritech research | PT9901 | For making worm picks. 99.5% Platinum, 0.5% Iridium. This comes as 3 ft/pack, which is sufficient for making 36 worm picks (~1 inch platinum wire per pick). |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | Diascopic base with focus mount, integrated LED module, power cord, 6.7x to 50x Zoom range [WD 115 mm], Widefield Eyepiece C-15x/17 (Note: equivalent stereomicroscopes are available from other manufacturers.) |
| worm pick handle | Tritech research | TWPH1 | For making worm picks. Mount ~1 in platinum wire into worm pick handle. Alternatively, worm picks can be made by mounting platinum wire in a glass Pasteur pipette. |
References
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