Het meten van de embryonale levensvatbaarheid en broedgrootte bij Caenorhabditis elegans
Summary
Hier presenteren we een algemene methode om de embryonale levensvatbaarheid en het totale aantal geproduceerde embryo’s (broed) te bepalen met behulp van het modelorganisme C. elegans.
Abstract
Caenorhabditis elegans is een uitstekend modelorganisme voor de studie van meiose, bevruchting en embryonale ontwikkeling. C. elegans bestaan als zelfbevruchtende hermafrodieten, die grote broedsels van nakomelingen produceren – wanneer mannetjes aanwezig zijn, kunnen ze nog grotere broedsels van kruisprogenageslacht produceren. Fouten in meiose, bevruchting en embryogenese kunnen snel worden beoordeeld als fenotypen van steriliteit, verminderde vruchtbaarheid of embryonale letaliteit. Dit artikel beschrijft een methode om de embryonale levensvatbaarheid en broedgrootte bij C. elegans te bepalen. We laten zien hoe je deze test kunt opzetten door een worm te plukken op een individuele Modified Youngren’s, Only Bacto-peptone (MYOB) plaat, het juiste tijdsbestek vast te stellen om levensvatbare nakomelingen en niet-levensvatbare embryo’s te tellen, en uitleggen hoe je levende wormmonsters nauwkeurig kunt tellen. Deze techniek kan worden gebruikt om de levensvatbaarheid te bepalen bij zelfbevruchtende hermafrodieten en kruisbestuiving door paringparingen. Deze relatief eenvoudige experimenten zijn gemakkelijk te adopteren voor nieuwe onderzoekers, zoals niet-gegradueerde studenten en eerstejaars afgestudeerde studenten.
Introduction
Seksuele voortplanting in eukaryote organismen vereist de productie van functionele gameten die samensmelten tot een embryo door het proces van bevruchting. Maternale en vaderlijke gameten, eicellen en sperma worden gemaakt door de gespecialiseerde celdelings- en differentiatieprocessen van meiose en gametogenese1. Meiose begint met een enkele diploïde cel en eindigt met de vorming van dochtercellen die de helft van het aantal chromosomen van de oorspronkelijke oudercel bevatten. Van het verminderen van ploïdie tot het schuifelen van genetisch materiaal via onafhankelijk assortiment en crossover-recombinatie, meiose heeft meerdere belangrijke functies1. Fouten in meiose kunnen leiden tot aneuploïdie, waarbij er te veel of te weinig chromosomen in een gameet zitten. Incidenties van aneuploïdie hebben enorme gevolgen voor de menselijke gezondheid, omdat chromosomale onevenwichtigheden een belangrijke oorzaak zijn van miskramen en ontwikkelingsstoornissen zoals het syndroom van Down en het syndroom van Edwards2.
Bevruchting is het proces waarbij de maternale en vaderlijke gameten samensmelten om een nieuw organismete genereren 3. Gameten-gametenherkenning wordt vergemakkelijkt door eiwitten op het gametenoppervlak3. Fouten met gametencompatibiliteit leiden tot onvruchtbaarheid omdat sperma- en eifusie niet kan doorgaan. De fusie van sperma met een eicel veroorzaakt een groot aantal gebeurtenissen die leiden tot de juiste vorming van een actief embryo dat de ontwikkelingsreis van een eencellig embryo naar een volledig functioneel meercellig organisme via mitotische delingen kan beginnen4. Gedurende de embryogenese moeten moleculaire gebeurtenissen die de ontwikkeling reguleren strak worden gereguleerd en nauwkeurig worden getimed om een goede groei van het organisme mogelijk te maken5. Een goede cellulaire differentiatie tijdens de vroege ontwikkeling is cruciaal omdat het organisme overgaat van een pluripotent embryo naar een volwaardig organisme. Vanwege de complexiteit van deze gebeurtenissen kunnen verstoringen leiden tot ontwikkelingsstoornissen die resulteren in embryonale letaliteit.
Caenorhabditis elegans is een uitstekend modelorganisme om meiose, bevruchting en embryonale ontwikkeling te bestuderen. C. elegans is een transparante nematode die twee geslachten heeft, mannetjes en hermafrodieten. C. elegans hermafrodieten, die in staat zijn tot zelfbevruchting, zijn het overheersende geslacht 6,7. De hermafrodiet gonade produceert eerst sperma tijdens het vierde larvale (L4) stadium, dat wordt opgeslagen in de spermatheca. Bij de overgang van L4 naar volwassenheid schakelt de kiembaan over op het produceren van eicellen, die vervolgens worden bevrucht via het opgeslagen sperma. Mannetjes, die voorkomen in hermafrodieten met een snelheid van minder dan 0,2%, produceren alleen sperma en kunnen paren met hermafrodieten. Bij kruisbestuiving overtreft mannelijk sperma hermafrodiet sperma bij de bevruchting van eicellen8. Dit maakt het relatief eenvoudig in stand houden van homozygote mutanten door zelfbevruchtende voorraden en voor genetische manipulaties door genetische kruisingen. De twee geslachten maken studies mogelijk die verschillen tussen meiose in mannelijke en vrouwelijke kiembanen onderzoeken. Verder, vanwege de transparante aard van C. elegans en zijn eieren, kunnen de processen van meiose, gametogenese, bevruchting en embryogenese worden bestudeerd in levende, intacte dieren met behulp van fluorescentiebeeldvormingstechnieken.
Bij het analyseren van nieuwe mutaties in genen die een rol kunnen spelen bij meiose, bevruchting en / of embryonale ontwikkeling in C. elegans, is een cruciale eerste stap het bepalen van de embryonale levensvatbaarheid en broedgrootte, omdat fouten in deze processen vaak leiden tot een mislukking of vermindering van de productie van levensvatbare nakomelingen. Dit artikel beschrijft een protocol voor het beoordelen van vruchtbaarheid, embryonale levensvatbaarheid en broedgrootte van zelfbevruchtende hermafrodieten of kruisingen tussen hermafrodieten en mannetjes. Hoewel deze klassieke test in veel C. elegans-onderzoeken is gebruikt, bieden we een gestandaardiseerd protocol voor het instellen en nauwkeurig kwantificeren. In dit protocol worden individuele wormen of mannelijke / hermafrodiete paren geïsoleerd om paring en nageslachtsproductie mogelijk te maken. De productie en levensvatbaarheid van het nageslacht worden gedurende een reeks dagen waargenomen om het aantal levensvatbare nakomelingen en niet-levensvatbare embryo’s te bepalen. Aan het einde van het experiment worden individuele broedsels geanalyseerd om het embryonale levensvatbaarheidspercentage en de totale broedgrootte te berekenen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voortplanting van seksuele reproducerende soorten vereist de vorming van haploïde gameten (d.w.z. eieren en sperma) door meiose, die vervolgens worden verenigd bij de bevruchting, waardoor het diploïde chromosoomnummer wordt hersteld en de embryonale ontwikkeling wordt geïnitieerd. Fouten in een van deze processen kunnen leiden tot onvruchtbaarheid, embryonale letaliteit en / of geboorteafwijkingen. C. elegans is een krachtig modelsysteem om seksuele voortplanting te bestuderen. De effecten van genmutaties of genexpressie knockdown (bijv. RNA-interferentie) kunnen relatief snel en gemakkelijk worden beoordeeld met behulp van de embryonale levensvatbaarheid en broedgroottetests die hierboven zijn beschreven. We hebben deze methoden gebruikt voor de initiële karakterisering van genen die betrokken zijn bij meiotische chromosoomsegregatie en bevruchting / eicelactivering10,11,12. Een waargenomen vermindering van de embryonale levensvatbaarheid of broedgrootte duidt op een verstoring van meiose, gametogenese, bevruchting of embryogenese.
Omdat de embryonale levensvatbaarheid en broedgrootte relatief eenvoudig worden beoordeeld door het tellen van nakomelingen en een eenvoudige wiskundige berekening, zijn dit optimale inleidende experimenten voor beginnende onderzoeksners in het laboratorium of in de klas. Het gemak van de C. elegans-houderij en de economische voordelen maken ze bijzonder geschikt voor experimentele biologielessen. De studenten doen waardevolle onderzoekservaring op via C. elegans houderij, leren ontleedmicroscopen te gebruiken en kunnen biologische vragen stellen in een ontwikkelingssysteem die in een relatief korte tijd (ongeveer 5 dagen met het protocol beschreven in dit artikel) kunnen worden beantwoord.
De timing van het aantal nakomelingen is erg belangrijk voor embryonale levensvatbaarheidstests. Bij 20 °C duurt de embryogenese ongeveer 16 uur en reproductief volwassen volwassenen beginnen ongeveer 60 uur na het uitkomen eieren te leggen als L1-larven. Omdat de levenscyclus snel is, is het belangrijk om nakomelingen binnen het juiste venster te tellen, waardoor embryo’s voldoende tijd hebben om uit te komen, maar voordat de nakomelingen zelf eieren beginnen te leggen. Het is ook belangrijk op te merken dat groeiperioden variëren afhankelijk van de temperatuur. De groei is ongeveer 2,1 keer sneller bij 24-25 °C dan 15-16 °C en ongeveer 1,3 keer sneller bij 20 °C dan 15-16 °C13. In dit protocol raden we aan dat tellingen 48 uur nadat de volwassenen op een vers bord zijn geplaatst, plaatsvinden. Dit tijdsbestek zorgt ervoor dat alle embryo’s met een wildtype ontwikkeling voldoende tijd hebben om uit te komen (>16 uur), maar niet verouderen tot het punt van voortplantingsvermogen. Tests die worden uitgevoerd bij temperaturen lager dan 20 °C moeten mogelijk worden uitgebreid (dieren gedurende 4 dagen terugplaatsen) voordat embryo’s uitkomen en voor uitgekomen nakomelingen larvale stadia bereiken die gemakkelijker waarneembaar zijn tussen de bacteriën op de MYOB-platen (L3-L4-stadia).
Een beperking van embryonale levensvatbaarheidstests en broedgrootte is dat het specifieke ontwikkelingsproces dat wordt verstoord niet direct duidelijk is. Deze initiële testen kunnen echter worden gevolgd met cytologische technieken om te bepalen welk proces wordt beïnvloed. Bijvoorbeeld, dissectie van de volwassen wormen om de gonade vrij te geven, gevolgd door 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) kleuring en zorgvuldige analyse van DNA-morfologie in de kiembaan kan onthullen of meiotische processen worden verstoord. Bovendien kan DAPI-kleuring van embryo’s onthullen in welk stadium embryogenese stopt.
Tot slot hebben we een protocol beschreven voor het bepalen van het aantal geproduceerde embryo’s (broed) en het percentage embryo’s dat levensvatbaar is voor verschillende C. elegans-mutanten. Deze test kan worden gebruikt voor zowel zelfbevruchtende hermafrodieten als voor mannelijke / hermafrodiete kruisingen. Met de korte levenscyclus van C. elegans kan dit protocol in minder dan 1 week worden voltooid. Embryonale levensvatbaarheidstests en broedgroottes kunnen worden gebruikt als eerste analyses van genen die betrokken zijn bij meiose, bevruchting of embryonale ontwikkeling, en zijn geschikte protocollen voor meer geavanceerde onderzoekers en onderzoeksbeginners (niet-gegradueerde en eerstejaars afgestudeerde studenten).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk in het Jaramillo-Lambert-lab wordt ondersteund door de National Institutes of Health NIGMS R35GM142524. Alle C. elegans-stammen werden geleverd door het Caenorhabditis Genetics Center, dat wordt gefinancierd door de National Institutes of Health, P40 OD010440. Figuur 1D is gemaakt met behulp van Biorender.com.
Materials
| Materials | |||
| 35 mm Petri dishes | Tritech research | T3501 | Semi-stackable, non-vented. |
| Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For MYOB |
| Bacto-Peptone | Gibco | 211677 | For MYOB |
| Cholestrol | Sigma | C8503 | For MYOB |
| Sodium Chloride | J.T. Baker | FW 58.440 | For MYOB |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | For MYOB |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253 | For MYOB |
| Strains | |||
| C. elegans wild type strain | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | |
| Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| him-5(e1490) | Caenorhabditis Genetics Center | DR466 | |
| spo-11(ok79) | Caenorhabditis Genetics Center | AV106 | |
| Equipment/software | |||
| Differential cell counter | Fischer Scientific | 02-670-12 | |
| MicroSoft Excel or Prism | MicroSoft or GraphPad | For recording and creating graphical representations of data. | |
| platinum wire | Tritech research | PT9901 | For making worm picks. 99.5% Platinum, 0.5% Iridium. This comes as 3 ft/pack, which is sufficient for making 36 worm picks (~1 inch platinum wire per pick). |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | Diascopic base with focus mount, integrated LED module, power cord, 6.7x to 50x Zoom range [WD 115 mm], Widefield Eyepiece C-15x/17 (Note: equivalent stereomicroscopes are available from other manufacturers.) |
| worm pick handle | Tritech research | TWPH1 | For making worm picks. Mount ~1 in platinum wire into worm pick handle. Alternatively, worm picks can be made by mounting platinum wire in a glass Pasteur pipette. |
References
- Hillers, K., Jantsch, V., Martinez-Perez, E., Yanowitz, J. Meiosis. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , (2017).
- O’Connor, C. Chromosomal abnormalities: aneuploidies. Nature Education. 1 (1), 172 (2008).
- Marcello, M. R., Singaravelu, G., Fertilization Singson, A. Fertilization. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 321-350 (2013).
- Marcello, M. R., Singson, A. Fertilization and the oocyte-to-embryo transition in C. elegans. BMB Reports. 43 (6), 389-399 (2010).
- Robertson, S., Lin, R. The oocyte-to-embryo transition. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 351-372 (2013).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-31 (2015).
- Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. Nondisjunction mutants of the nematode CAENORHABDITIS ELEGANS. Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).
- Chu, D. S., Shakes, D. C. Spermatogenesis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 171-203 (2013).
- Dernburg, A. F., et al. Meiotic recombination in C. elegans initiates by a conserved mechanism and is dispensable for homologous chromosome synapsis. Cell. 94 (3), 387-398 (1998).
- Bhandari, N., et al. Identification of suppressors of top-2 embryonic lethality in Caenorhabditis elegans. G3. 3 (4), 1183-1191 (2020).
- Jaramillo-Lambert, A., Fabritius, A. S., Hansen, T. J., Smith, H. E., Golden, A. The identification of a novel mutant allele of topoisomerase II in Caenorhabditis elegans reveals a unique role in chromosome segregation during spermatogenesis. Genetics. 204 (4), 1407-1422 (2016).
- Jaramillo-Lambert, A., Golden, A. The C-terminus of SPE-11 is required for proper embryonic development in C. elegans. microPublication Biology. , (2020).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).
