قياس الصلاحية الجنينية وحجم الحضنة في Caenorhabditis elegans
Summary
هنا ، نقدم طريقة عامة لتحديد الصلاحية الجنينية والعدد الإجمالي للأجنة المنتجة (الحضنة) باستخدام الكائن الحي النموذجي C. elegans.
Abstract
Caenorhabditis elegans هو كائن نموذجي ممتاز لدراسة الانقسام الاختزالي والإخصاب والتطور الجنيني. توجد C. elegans كخنثى ذاتية الإخصاب ، والتي تنتج حضنات كبيرة من النسل – عندما يكون الذكور موجودين ، يمكنهم إنتاج حضنات أكبر من ذرية متقاطعة. يمكن تقييم الأخطاء في الانقسام الميوزي والإخصاب والتطور الجنيني بسرعة على أنها أنماط ظاهرية للعقم أو انخفاض الخصوبة أو الفتك الجنيني. توضح هذه المقالة طريقة لتحديد الصلاحية الجنينية وحجم الحضنة في C. elegans. نوضح كيفية إعداد هذا الفحص عن طريق اختيار دودة على لوحة فردية معدلة من Youngren ، فقط Bacto-peptone (MYOB) ، وتحديد الإطار الزمني المناسب لحساب النسل القابل للحياة والأجنة غير القابلة للحياة ، وشرح كيفية حساب عينات الدودة الحية بدقة. يمكن استخدام هذه التقنية لتحديد الجدوى في خنثى الإخصاب الذاتي وكذلك الإخصاب المتبادل عن طريق أزواج التزاوج. هذه التجارب البسيطة نسبيا يمكن تبنيها بسهولة للباحثين الجدد ، مثل طلاب البكالوريوس وطلاب الدراسات العليا في السنة الأولى.
Introduction
يتطلب التكاثر الجنسي في الكائنات الحقيقية النوى إنتاج جاميتات وظيفية تندمج لتكوين جنين من خلال عملية الإخصاب. يتم إنشاء الأمشاج الأم والأب والبويضة (البويضات) والحيوانات المنوية من خلال عمليات الانقسام الخلوي والتمايز المتخصصة للانقسام الميوزيوتكوين الأمشاج 1. يبدأ الانقسام الميوزي بخلية واحدة ثنائية الصيغة الصبغية، وينتهي بتكوين خلايا بنوية تحتوي على نصف عدد كروموسومات الخلية الأبوية الأصلية. من الحد من الصيغة الصبغية إلى خلط المواد الوراثية عبر تشكيلة مستقلة وإعادة التركيب المتقاطع ، يخدم الانقسام الاختزالي وظائف مهمة متعددة1. يمكن أن تؤدي الأخطاء داخل الانقسام الميوزي إلى اختلال الصيغة الصبغية، حيث يوجد عدد كبير جدا أو قليل جدا من الكروموسومات داخل الجاميت. حالات اختلال الصيغة الصبغية لها تأثيرات هائلة على صحة الإنسان ، حيث أن اختلالات الكروموسومات هي سبب رئيسي للإجهاض واضطرابات النمو مثل متلازمة داون ومتلازمة إدواردز2.
الإخصاب هو العملية التي تندمج بها الأمشاج الأم والأب لتوليد كائن حي جديد3. يتم تسهيل التعرف على الأمشاج بواسطة البروتينات الموجودة على سطح الأمشاج3. تؤدي أخطاء توافق الأمشاج إلى العقم لأن اندماج الحيوانات المنوية والبويضات غير قادر على المضي قدما. يؤدي اندماج الحيوانات المنوية مع البويضة إلى مجموعة من الأحداث التي تؤدي إلى التكوين الصحيح للجنين النشط الذي يمكن أن يبدأ رحلة النمو من جنين وحيد الخلية إلى كائن متعدد الخلايا يعمل بكامل طاقته عبر الانقساماتالانقسامية 4. خلال التطور الجنيني ، يجب تنظيم الأحداث الجزيئية التي تنظم التطور بإحكام وتوقيتها بدقة لتمكين النمو السليم للكائن الحي5. يعد التمايز الخلوي السليم أثناء التطور المبكر أمرا بالغ الأهمية حيث ينتقل الكائن الحي من جنين متعدد القدرات إلى كائن حي كامل. بسبب تعقيدات هذه الأحداث ، يمكن أن تؤدي الاضطرابات إلى عيوب في النمو تؤدي إلى الفتك الجنيني.
Caenorhabditis elegans هو كائن نموذجي ممتاز لدراسة الانقسام الاختزالي والإخصاب والتطور الجنيني. C. elegans هي نيماتودا شفافة لها جنسان ، ذكور وخثى. C. elegans خنثى ، والتي هي قادرة على الإخصاب الذاتي ، هي الجنس السائد 6,7. تنتج الغدد التناسلية الأنثوية الحيوانات المنوية أولا خلال المرحلة اليرقية الرابعة (L4) ، والتي يتم تخزينها في الحيوانات المنوية. في الانتقال من L4 إلى مرحلة البلوغ ، يتحول الخط الجرثومي إلى إنتاج البويضات ، والتي يتم تخصيبها بعد ذلك عن طريق الحيوانات المنوية المخزنة. الذكور ، التي تنشأ في الخنثى بمعدل أقل من 0.2 ٪ ، تنتج فقط الحيوانات المنوية ويمكن أن تتزاوج مع الخنثى. عند الإخصاب المتبادل ، تتفوق الحيوانات المنوية الذكرية على الحيوانات المنوية الخنثى في إخصاب البويضات8. وهذا يسمح بالحفاظ بسهولة نسبية على الطفرات متماثلة الزيجوت من خلال مخزونات الإخصاب الذاتي والتلاعب الجيني من خلال التهجين الجيني. يسمح الجنسان بإجراء دراسات تستكشف الاختلافات بين الانقسام الاختزالي في خطوط الجراثيم الذكرية والأنثوية. علاوة على ذلك ، نظرا للطبيعة الشفافة ل C. elegans وبيضها ، يمكن دراسة عمليات الانقسام الاختزالي ، وتكوين الأمشاج ، والإخصاب ، والتطور الجنيني في الحيوانات الحية السليمة باستخدام تقنيات التصوير الفلوري.
عند تحليل الطفرات الجديدة في الجينات التي قد تلعب دورا في الانقسام الاختزالي والإخصاب و / أو التطور الجنيني في C. elegans ، فإن الخطوة الأولى الحاسمة هي تحديد الصلاحية الجنينية وحجم الحضنة لأن الأخطاء في هذه العمليات غالبا ما تؤدي إلى فشل أو انخفاض في إنتاج ذرية قابلة للحياة. تصف هذه الورقة بروتوكولا لتقييم الخصوبة ، والصلاحية الجنينية ، وحجم الحضنة إما من خنثى ذاتية الإخصاب أو تهجين بين الخنثى والذكور. بينما تم استخدام هذا الفحص الكلاسيكي في العديد من دراسات C. elegans ، فإننا نقدم بروتوكولا موحدا للإعداد والقياس الكمي الدقيق. في هذا البروتوكول ، يتم عزل الديدان الفردية أو أزواج الذكور / الخنثى للسماح بالتزاوج وإنتاج النسل. تتم ملاحظة إنتاج النسل وصلاحيته على مدى سلسلة من الأيام لتحديد عدد النسل القابل للحياة والأجنة غير القابلة للحياة. في ختام التجربة ، يتم تحليل الحضنة الفردية لحساب نسبة الصلاحية الجنينية والحجم الكلي للحضنة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتطلب تكاثر الأنواع التي تتكاثر جنسيا تكوين جاميتات أحادية الصيغة الصبغية (أي البويضات والحيوانات المنوية) من خلال الانقسام الميوزي، والتي تتحد بعد ذلك عند الإخصاب، واستعادة عدد الكروموسومات الثنائية الصيغة الصبغية وبدء التطور الجنيني. يمكن أن تؤدي الأخطاء في أي من هذه العمليات إلى العقم و / أو الفتك الجنيني و / أو العيوب الخلقية. C. elegans هو نظام نموذجي قوي لدراسة التكاثر الجنسي. يمكن تقييم آثار الطفرات الجينية أو ضربة قاضية للتعبير الجيني (على سبيل المثال ، تداخل الحمض النووي الريبي) بسرعة وسهولة نسبيا باستخدام مقايسات الجدوى الجنينية وتحجيم الحضنة الموصوفة أعلاه. لقد استخدمنا هذه الطرق للتوصيف الأولي للجينات المشاركة في فصل الكروموسومات الاختزالية والإخصاب / تنشيط البويضة10،11،12. يشير الانخفاض الملحوظ في الصلاحية الجنينية أو حجم الحضنة إلى حدوث اضطراب في الانقسام الاختزالي أو تكوين الأمشاج أو الإخصاب أو التطور الجنيني.
نظرا لأن الجدوى الجنينية وحجم الحضنة يتم تقييمهما بسهولة نسبية من خلال عد النسل وحساب رياضي بسيط ، فهذه تجارب تمهيدية مثالية للمبتدئين في البحث سواء في المختبر أو الفصل الدراسي. سهولة تربية C. elegans والمزايا الاقتصادية تجعلها مناسبة بشكل خاص لفصول البيولوجيا التجريبية. يكتسب الطلاب خبرة بحثية قيمة من خلال تربية C. elegans ، ويتعلمون استخدام المجاهر التشريحية ، ويمكنهم طرح أسئلة بيولوجية في نظام تنموي يمكن الإجابة عليه في فترة زمنية قصيرة نسبيا (حوالي 5 أيام مع البروتوكول الموضح في هذه الورقة).
توقيت تعداد النسل مهم جدا لمقايسات الصلاحية الجنينية. عند 20 درجة مئوية ، يستغرق التطور الجنيني حوالي 16 ساعة ، ويبدأ البالغون الناضجون تناسليا في وضع البيض بعد حوالي 60 ساعة من الفقس على شكل يرقات L1. نظرا لأن دورة الحياة سريعة ، فمن المهم حساب النسل ضمن النافذة المناسبة ، مما يتيح وقتا كافيا لفقس الأجنة ولكن قبل أن يبدأ النسل نفسه في وضع البيض. من المهم أيضا ملاحظة أن فترات النمو تختلف حسب درجة الحرارة. النمو أسرع بحوالي 2.1 مرة عند 24-25 درجة مئوية من 15-16 درجة مئوية ، وحوالي 1.3 مرة أسرع عند 20 درجة مئوية من 15-16 درجة مئوية13. في هذا البروتوكول ، نوصي بأن تحدث الأعداد بعد 48 ساعة من وضع البالغين على طبق جديد. يضمن هذا الإطار الزمني أن جميع الأجنة ذات التطور البري لديها الوقت الكافي للفقس (>16 ساعة) ، ولكنها لا تتقدم في العمر إلى درجة القدرة الإنجابية. قد يلزم تمديد المقايسات التي يتم إجراؤها في درجات حرارة أقل من 20 درجة مئوية (نقل الحيوانات لمدة 4 أيام) حتى تفقس الأجنة ولكي تصل ذرية الفقس إلى مراحل اليرقات التي يسهل ملاحظتها بين البكتيريا الموجودة على ألواح MYOB (مراحل L3-L4).
من القيود المفروضة على مقايسات الجدوى الجنينية وتحجيم الحضنة أن عملية النمو المحددة المضطربة ليست واضحة بسهولة. ومع ذلك ، يمكن متابعة هذه المقايسات الأولية بتقنيات خلوية لتحديد العملية المتأثرة. على سبيل المثال ، يمكن أن يكشف تشريح الديدان البالغة لإطلاق الغدد التناسلية متبوعا بتلطيخ 4 ‘، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) والتحليل الدقيق لمورفولوجيا الحمض النووي داخل الخط الجرثومي ما إذا كانت العمليات الاختزالية قد تعطلت. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يكشف تلطيخ الأجنة DAPI عن المرحلة التي يتوقف فيها التطور الجنيني.
في الختام ، وصفنا بروتوكولا لفحص عدد الأجنة المنتجة (الحضنة) والنسبة المئوية للأجنة القابلة للحياة لمختلف طفرات C. elegans. يمكن استخدام هذا الاختبار لكل من الخنثى ذاتية الإخصاب والصلبان الذكرية / الخنثى. مع دورة حياة قصيرة من C. elegans ، يمكن إكمال هذا البروتوكول في أقل من 1 أسبوع. يمكن استخدام مقايسات الجدوى الجنينية وأحجام الحضنة كتحليلات أولية للجينات المشاركة في الانقسام الاختزالي أو الإخصاب أو التطور الجنيني ، وهي بروتوكولات مناسبة للباحثين والمبتدئين في البحث الأكثر تقدما (طلاب الدراسات العليا في المرحلة الجامعية والسنة الأولى) على حد سواء.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم العمل في مختبر جاراميلو لامبرت من قبل المعاهد الوطنية للصحة NIGMS R35GM142524. تم توفير جميع سلالات C. elegans من قبل مركز Caenorhabditis Genetics ، الذي تموله المعاهد الوطنية للصحة ، P40 OD010440. تم إنشاء الشكل 1D باستخدام Biorender.com.
Materials
| Materials | |||
| 35 mm Petri dishes | Tritech research | T3501 | Semi-stackable, non-vented. |
| Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For MYOB |
| Bacto-Peptone | Gibco | 211677 | For MYOB |
| Cholestrol | Sigma | C8503 | For MYOB |
| Sodium Chloride | J.T. Baker | FW 58.440 | For MYOB |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | For MYOB |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253 | For MYOB |
| Strains | |||
| C. elegans wild type strain | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | |
| Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| him-5(e1490) | Caenorhabditis Genetics Center | DR466 | |
| spo-11(ok79) | Caenorhabditis Genetics Center | AV106 | |
| Equipment/software | |||
| Differential cell counter | Fischer Scientific | 02-670-12 | |
| MicroSoft Excel or Prism | MicroSoft or GraphPad | For recording and creating graphical representations of data. | |
| platinum wire | Tritech research | PT9901 | For making worm picks. 99.5% Platinum, 0.5% Iridium. This comes as 3 ft/pack, which is sufficient for making 36 worm picks (~1 inch platinum wire per pick). |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | Diascopic base with focus mount, integrated LED module, power cord, 6.7x to 50x Zoom range [WD 115 mm], Widefield Eyepiece C-15x/17 (Note: equivalent stereomicroscopes are available from other manufacturers.) |
| worm pick handle | Tritech research | TWPH1 | For making worm picks. Mount ~1 in platinum wire into worm pick handle. Alternatively, worm picks can be made by mounting platinum wire in a glass Pasteur pipette. |
References
- Hillers, K., Jantsch, V., Martinez-Perez, E., Yanowitz, J. Meiosis. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , (2017).
- O’Connor, C. Chromosomal abnormalities: aneuploidies. Nature Education. 1 (1), 172 (2008).
- Marcello, M. R., Singaravelu, G., Fertilization Singson, A. Fertilization. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 321-350 (2013).
- Marcello, M. R., Singson, A. Fertilization and the oocyte-to-embryo transition in C. elegans. BMB Reports. 43 (6), 389-399 (2010).
- Robertson, S., Lin, R. The oocyte-to-embryo transition. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 351-372 (2013).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-31 (2015).
- Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. Nondisjunction mutants of the nematode CAENORHABDITIS ELEGANS. Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).
- Chu, D. S., Shakes, D. C. Spermatogenesis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 171-203 (2013).
- Dernburg, A. F., et al. Meiotic recombination in C. elegans initiates by a conserved mechanism and is dispensable for homologous chromosome synapsis. Cell. 94 (3), 387-398 (1998).
- Bhandari, N., et al. Identification of suppressors of top-2 embryonic lethality in Caenorhabditis elegans. G3. 3 (4), 1183-1191 (2020).
- Jaramillo-Lambert, A., Fabritius, A. S., Hansen, T. J., Smith, H. E., Golden, A. The identification of a novel mutant allele of topoisomerase II in Caenorhabditis elegans reveals a unique role in chromosome segregation during spermatogenesis. Genetics. 204 (4), 1407-1422 (2016).
- Jaramillo-Lambert, A., Golden, A. The C-terminus of SPE-11 is required for proper embryonic development in C. elegans. microPublication Biology. , (2020).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).
