Medición de la viabilidad embrionaria y el tamaño de la cría en Caenorhabditis elegans
Summary
Aquí, presentamos un método general para determinar la viabilidad embrionaria y el número total de embriones producidos (cría) utilizando el organismo modelo C. elegans.
Abstract
Caenorhabditis elegans es un excelente organismo modelo para el estudio de la meiosis, la fertilización y el desarrollo embrionario. C. elegans existen como hermafroditas autofertilizantes, que producen grandes crías de progenie; cuando los machos están presentes, pueden producir crías aún más grandes de progenie cruzada. Los errores en la meiosis, la fertilización y la embriogénesis pueden evaluarse rápidamente como fenotipos de esterilidad, fertilidad reducida o letalidad embrionaria. Este artículo describe un método para determinar la viabilidad embrionaria y el tamaño de la cría en C. elegans. Demostramos cómo configurar este ensayo recogiendo un gusano en una placa individual de Youngren’s Only Bacto-peptone (MYOB), establecemos el marco de tiempo apropiado para contar la progenie viable y los embriones no viables, y explicamos cómo contar con precisión las muestras de gusanos vivos. Esta técnica se puede utilizar para determinar la viabilidad en hermafroditas autofertilizantes, así como la fertilización cruzada mediante parejas de apareamiento. Estos experimentos relativamente simples son fácilmente adoptables para nuevos investigadores, como estudiantes de pregrado y estudiantes de posgrado de primer año.
Introduction
La reproducción sexual en organismos eucariotas requiere la producción de gametos funcionales que se fusionan para formar un embrión a través del proceso de fertilización. Los gametos maternos y paternos, el óvulo (óvulos) y los espermatozoides se crean a través de los procesos especializados de división celular y diferenciación de la meiosis y la gametogénesis1. La meiosis comienza con una sola célula diploide y termina con la formación de células hijas que contienen la mitad del número de cromosomas de la célula parental original. Desde la reducción de la ploidía hasta la mezcla de material genético a través del surtido independiente y la recombinación cruzada, la meiosis cumple múltiples funciones importantes1. Los errores dentro de la meiosis pueden resultar en aneuploidía, en la que hay demasiados o muy pocos cromosomas dentro de un gameto. Las incidencias de aneuploidía tienen un tremendo impacto en la salud humana, ya que los desequilibrios cromosómicos son una causa importante de abortos espontáneos y trastornos del desarrollo como el síndrome de Down y el síndrome de Edwards2.
La fecundación es el proceso por el cual los gametos materno y paterno se fusionan para generar un nuevo organismo3. El reconocimiento de gametos-gametos es facilitado por proteínas en la superficie del gameto3. Los errores con la compatibilidad de gametos conducen a la infertilidad ya que la fusión de espermatozoides y óvulos no puede continuar. La fusión de espermatozoides con un ovocito desencadena una serie de eventos que conducen a la formación adecuada de un embrión activo que puede comenzar el viaje de desarrollo de un embrión unicelular a un organismo multicelular completamente funcional a través de divisiones mitóticas4. A lo largo de la embriogénesis, los eventos moleculares que regulan el desarrollo deben estar estrechamente regulados y cronometrados con precisión para permitir el crecimiento adecuado del organismo5. La diferenciación celular adecuada durante el desarrollo temprano es crucial a medida que el organismo pasa de un embrión pluripotente a un organismo de pleno derecho. Debido a las complejidades de estos eventos, las interrupciones pueden conducir a defectos de desarrollo que resultan en letalidad embrionaria.
Caenorhabditis elegans es un excelente organismo modelo para estudiar la meiosis, la fertilización y el desarrollo embrionario. C. elegans es un nematodo transparente que tiene dos sexos, machos y hermafroditas. C. elegans hermafroditas, capaces de autofecundarse, son el sexo predominante 6,7. La gónada hermafrodita primero produce espermatozoides durante la cuarta etapa larvaria (L4), que se almacenan en la espermateca. En la transición de L4 a la edad adulta, la línea germinal cambia a la producción de ovocitos, que luego se fertilizan a través de los espermatozoides almacenados. Los machos, que surgen en los hermafroditas a una tasa de menos del 0,2%, solo producen espermatozoides y pueden aparearse con hermafroditas. Tras la fecundación cruzada, los espermatozoides masculinos superan a los espermatozoides hermafroditas en la fecundación de los ovocitos8. Esto permite el mantenimiento relativamente fácil de mutantes homocigotos a través de poblaciones autofertilizantes y manipulaciones genéticas a través de cruces genéticos. Los dos sexos permiten estudios que exploran las diferencias entre la meiosis en las líneas germinales masculinas y femeninas. Además, debido a la naturaleza transparente de C. elegans y sus huevos, los procesos de meiosis, gametogénesis, fertilización y embriogénesis se pueden estudiar en animales vivos e intactos utilizando técnicas de imágenes de fluorescencia.
Al analizar nuevas mutaciones en genes que pueden desempeñar un papel en la meiosis, fertilización y / o desarrollo embrionario en C. elegans, un primer paso crucial es determinar la viabilidad embrionaria y el tamaño de la cría, ya que los errores en estos procesos a menudo conducen a una falla o reducción en la producción de progenie viable. Este documento describe un protocolo para evaluar la fertilidad, la viabilidad embrionaria y el tamaño de la cría de hermafroditas autofertilizantes o cruces entre hermafroditas y machos. Si bien este ensayo clásico se ha utilizado en muchos estudios de C. elegans , proporcionamos un protocolo estandarizado para la configuración y cuantificación precisa. En este protocolo, se aíslan gusanos individuales o pares macho/hermafrodita para permitir el apareamiento y la producción de progenie. La producción y viabilidad de la progenie se observa durante una serie de días para determinar el número de progenies viables y embriones no viables. Al concluir el experimento, se analizan las crías individuales para calcular el porcentaje de viabilidad embrionaria y el tamaño total de la cría.
Protocol
Representative Results
Discussion
La propagación de especies que se reproducen sexualmente requiere la formación de gametos haploides (es decir, óvulos y espermatozoides) a través de la meiosis, que luego se unifican en la fertilización, restaurando el número de cromosomas diploides e iniciando el desarrollo embrionario. Los errores en cualquiera de estos procesos pueden conducir a la infertilidad, letalidad embrionaria y / o defectos de nacimiento. C. elegans es un poderoso sistema modelo para estudiar la reproducción sexual. Los efectos de las mutaciones génicas o la eliminación de la expresión génica (por ejemplo, interferencia de ARN) se pueden evaluar con relativa rapidez y facilidad utilizando los ensayos de viabilidad embrionaria y tamaño de cría descritos anteriormente. Hemos utilizado estos métodos para la caracterización inicial de genes implicados en la segregación cromosómica meiótica y la fertilización/activación del óvulo10,11,12. Una reducción observada en la viabilidad embrionaria o el tamaño de la cría indica una interrupción en la meiosis, gametogénesis, fertilización o embriogénesis.
Como la viabilidad embrionaria y el tamaño de las crías se evalúan con relativa facilidad mediante el conteo de la progenie y un cálculo matemático simple, estos son experimentos introductorios óptimos para los principiantes en investigación, ya sea en el laboratorio o en el aula. La facilidad de cría de C. elegans y las ventajas económicas los hacen particularmente adecuados para las clases de biología experimental. Los estudiantes adquieren una valiosa experiencia de investigación a través de la cría de C. elegans , aprenden a usar microscopios de disección y pueden hacer preguntas biológicas en un sistema de desarrollo que se pueden responder en un período de tiempo relativamente corto (aproximadamente 5 días con el protocolo descrito en este documento).
El momento de los recuentos de progenie es muy importante para los ensayos de viabilidad embrionaria. A 20 °C, la embriogénesis dura aproximadamente 16 h, y los adultos reproductivamente maduros comienzan a poner huevos aproximadamente 60 h después de la eclosión como larvas L1. Como el ciclo de vida es rápido, es importante contar la progenie dentro de la ventana apropiada, dando tiempo suficiente para que los embriones eclosionen, pero antes de que la progenie comience a poner huevos. También es importante tener en cuenta que los períodos de crecimiento varían dependiendo de la temperatura. El crecimiento es aproximadamente 2,1 veces más rápido a 24-25 °C que a 15-16 °C, y aproximadamente 1,3 veces más rápido a 20 °C que a 15-16 °C13. En este protocolo, recomendamos que los recuentos ocurran 48 h después de que los adultos se colocan en un plato nuevo. Este período de tiempo asegura que todos los embriones con desarrollo de tipo salvaje tengan tiempo suficiente para eclosionar (>16 h), pero no envejecen hasta el punto de la capacidad reproductiva. Los ensayos realizados a temperaturas inferiores a 20 °C pueden necesitar ser extendidos (animales de transferencia durante 4 días) para que los embriones eclosionen y para que la progenie eclosionada alcance etapas larvales que son más fáciles de observar entre las bacterias en las placas MYOB (etapas L3-L4).
Una limitación para los ensayos de viabilidad embrionaria y el tamaño de las crías es que el proceso de desarrollo específico que se perturba no es evidente. Sin embargo, estos ensayos iniciales pueden ser seguidos con técnicas citológicas para determinar qué proceso está afectado. Por ejemplo, la disección de los gusanos adultos para liberar la gónada seguida de tinción de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y un análisis cuidadoso de la morfología del ADN dentro de la línea germinal pueden revelar si los procesos meióticos se interrumpen. Además, la tinción DAPI de embriones puede revelar en qué etapa se detiene la embriogénesis.
En conclusión, hemos descrito un protocolo para analizar el número de embriones producidos (cría) y el porcentaje de embriones que son viables para varios mutantes de C. elegans. Este ensayo se puede utilizar tanto para hermafroditas autofertilizantes como para cruces masculinos / hermafroditas. Con el corto ciclo de vida de C. elegans, este protocolo se puede completar en menos de 1 semana. Los ensayos de viabilidad embrionaria y los tamaños de cría se pueden utilizar como primeros análisis de genes involucrados en la meiosis, la fertilización o el desarrollo embrionario, y son protocolos apropiados para investigadores más avanzados y novatos en investigación (estudiantes de pregrado y posgrado de primer año) por igual.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo en el laboratorio Jaramillo-Lambert está respaldado por los Institutos Nacionales de Salud NIGMS R35GM142524. Todas las cepas de C. elegans fueron proporcionadas por el Centro de Genética Caenorhabditis , financiado por los Institutos Nacionales de Salud, P40 OD010440. La figura 1D se creó utilizando Biorender.com.
Materials
| Materials | |||
| 35 mm Petri dishes | Tritech research | T3501 | Semi-stackable, non-vented. |
| Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For MYOB |
| Bacto-Peptone | Gibco | 211677 | For MYOB |
| Cholestrol | Sigma | C8503 | For MYOB |
| Sodium Chloride | J.T. Baker | FW 58.440 | For MYOB |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | For MYOB |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253 | For MYOB |
| Strains | |||
| C. elegans wild type strain | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | |
| Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| him-5(e1490) | Caenorhabditis Genetics Center | DR466 | |
| spo-11(ok79) | Caenorhabditis Genetics Center | AV106 | |
| Equipment/software | |||
| Differential cell counter | Fischer Scientific | 02-670-12 | |
| MicroSoft Excel or Prism | MicroSoft or GraphPad | For recording and creating graphical representations of data. | |
| platinum wire | Tritech research | PT9901 | For making worm picks. 99.5% Platinum, 0.5% Iridium. This comes as 3 ft/pack, which is sufficient for making 36 worm picks (~1 inch platinum wire per pick). |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | Diascopic base with focus mount, integrated LED module, power cord, 6.7x to 50x Zoom range [WD 115 mm], Widefield Eyepiece C-15x/17 (Note: equivalent stereomicroscopes are available from other manufacturers.) |
| worm pick handle | Tritech research | TWPH1 | For making worm picks. Mount ~1 in platinum wire into worm pick handle. Alternatively, worm picks can be made by mounting platinum wire in a glass Pasteur pipette. |
References
- Hillers, K., Jantsch, V., Martinez-Perez, E., Yanowitz, J. Meiosis. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , (2017).
- O’Connor, C. Chromosomal abnormalities: aneuploidies. Nature Education. 1 (1), 172 (2008).
- Marcello, M. R., Singaravelu, G., Fertilization Singson, A. Fertilization. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 321-350 (2013).
- Marcello, M. R., Singson, A. Fertilization and the oocyte-to-embryo transition in C. elegans. BMB Reports. 43 (6), 389-399 (2010).
- Robertson, S., Lin, R. The oocyte-to-embryo transition. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 351-372 (2013).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-31 (2015).
- Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. Nondisjunction mutants of the nematode CAENORHABDITIS ELEGANS. Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).
- Chu, D. S., Shakes, D. C. Spermatogenesis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 171-203 (2013).
- Dernburg, A. F., et al. Meiotic recombination in C. elegans initiates by a conserved mechanism and is dispensable for homologous chromosome synapsis. Cell. 94 (3), 387-398 (1998).
- Bhandari, N., et al. Identification of suppressors of top-2 embryonic lethality in Caenorhabditis elegans. G3. 3 (4), 1183-1191 (2020).
- Jaramillo-Lambert, A., Fabritius, A. S., Hansen, T. J., Smith, H. E., Golden, A. The identification of a novel mutant allele of topoisomerase II in Caenorhabditis elegans reveals a unique role in chromosome segregation during spermatogenesis. Genetics. 204 (4), 1407-1422 (2016).
- Jaramillo-Lambert, A., Golden, A. The C-terminus of SPE-11 is required for proper embryonic development in C. elegans. microPublication Biology. , (2020).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).
