Измерение эмбриональной жизнеспособности и размера расплода у Caenorhabditis elegans
Summary
Здесь мы представляем общий метод определения эмбриональной жизнеспособности и общего количества эмбрионов, полученных (выводка) с использованием модельного организма C. elegans.
Abstract
Caenorhabditis elegans является отличным модельным организмом для изучения мейоза, оплодотворения и эмбрионального развития. C. elegans существуют как самооплодотворяющиеся гермафродиты, которые производят большие выводки потомства – когда присутствуют самцы, они могут производить еще более крупные выводки перекрестного потомства. Ошибки в мейозе, оплодотворении и эмбриогенезе могут быть быстро оценены как фенотипы бесплодия, снижения фертильности или эмбриональной летальности. В данной статье описан метод определения эмбриональной жизнеспособности и размера выводка у C. elegans. Мы демонстрируем, как настроить этот анализ, выбирая червя на отдельной пластине модифицированного Youngren’s, только бакто-пептона (MYOB), устанавливаем соответствующие временные рамки для подсчета жизнеспособного потомства и нежизнеспособных эмбрионов и объясняем, как точно подсчитывать живые образцы червей. Этот метод может быть использован для определения жизнеспособности у самооплодотворяющихся гермафродитов, а также перекрестного опыления спаривающимися парами. Эти относительно простые эксперименты легко адаптируются для новых исследователей, таких как студенты бакалавриата и аспиранты-первокурсники.
Introduction
Половое размножение у эукариотических организмов требует производства функциональных гамет, которые сливаются, образуя эмбрион в процессе оплодотворения. Материнские и отцовские гаметы, яйцеклетки (яйцеклетки) и сперматозоиды создаются посредством специализированных процессов деления и дифференцировки клеток мейоза и гаметогенеза1. Мейоз начинается с одной диплоидной клетки и заканчивается образованием дочерних клеток, которые содержат половину количества хромосом исходной родительской клетки. От уменьшения плоидности до перетасовки генетического материала посредством независимого ассортимента и кроссоверной рекомбинации мейоз выполняет несколько важных функций1. Ошибки в мейозе могут привести к анеуплоидии, при которой в гамете слишком много или слишком мало хромосом. Случаи анеуплоидии оказывают огромное влияние на здоровье человека, поскольку хромосомный дисбаланс является основной причиной выкидышей и нарушений развития, таких как синдром Дауна и синдром Эдвардса2.
Оплодотворение – это процесс, посредством которого материнские и отцовские гаметы сливаются, образуя новый организм3. Распознаванию гамет-гамет способствуют белки на поверхности гаметы3. Ошибки с совместимостью гамет приводят к бесплодию, так как слияние сперматозоидов и яйцеклеток не может продолжаться. Слияние сперматозоида с яйцеклеткой вызывает множество событий, которые приводят к правильному формированию активного эмбриона, который может начать путь развития от одноклеточного эмбриона до полностью функционального многоклеточного организма посредством митотических делений4. На протяжении всего эмбриогенеза молекулярные события, регулирующие развитие, должны быть жестко отрегулированы и точно рассчитаны по времени, чтобы обеспечить надлежащий рост организма5. Правильная клеточная дифференциация во время раннего развития имеет решающее значение, поскольку организм переходит от плюрипотентного эмбриона к полноценному организму. Из-за сложности этих событий нарушения могут привести к дефектам развития, которые приводят к эмбриональной летальности.
Caenorhabditis elegans — отличный модельный организм для изучения мейоза, оплодотворения и эмбрионального развития. C. elegans — прозрачная нематода, имеющая два пола: самцов и гермафродитов. Преобладающим поломявляются гермафродиты C. elegans, способные к самооплодотворению6,7. Гонада гермафродита сначала производит сперматозоиды на четвертой личиночной стадии (L4), которые хранятся в сперматеках. При переходе L4 во взрослую жизнь зародышевая линия переключается на производство ооцитов, которые затем оплодотворяются с помощью сохраненной спермы. Самцы, которые возникают у гермафродитов со скоростью менее 0,2%, производят только сперму и могут спариваться с гермафродитами. При перекрестном оплодотворении мужские сперматозоиды вытесняют сперматозоиды-гермафродиты в оплодотворенииооцитов 8. Это позволяет относительно легко поддерживать гомозиготных мутантов с помощью самооплодотворяющихся запасов и генетических манипуляций с помощью генетических скрещиваний. Два пола позволяют проводить исследования, изучающие различия между мейозом в мужских и женских зародышевых линиях. Кроме того, из-за прозрачной природы C. elegans и его яиц процессы мейоза, гаметогенеза, оплодотворения и эмбриогенеза могут быть изучены на живых, интактных животных с использованием методов флуоресцентной визуализации.
При анализе новых мутаций в генах, которые могут играть роль в мейозе, оплодотворении и/или эмбриональном развитии у C. elegans, важнейшим первым шагом является определение эмбриональной жизнеспособности и размера выводка, поскольку ошибки в этих процессах часто приводят к сбою или сокращению производства жизнеспособного потомства. В этой статье описывается протокол оценки фертильности, эмбриональной жизнеспособности и размера выводка либо самооплодотворяющихся гермафродитов, либо скрещивания гермафродитов с самцами. Хотя этот классический анализ использовался во многих исследованиях C. elegans , мы предоставляем стандартизированный протокол для настройки и точного количественного определения. В этом протоколе отдельные черви или пары самцов / гермафродитов изолируются, чтобы обеспечить спаривание и производство потомства. Производство потомства и жизнеспособность наблюдаются в течение ряда дней, чтобы определить количество жизнеспособного потомства и нежизнеспособных эмбрионов. По завершении эксперимента анализируются отдельные выводки, чтобы рассчитать процент эмбриональной жизнеспособности и общий размер выводка.
Protocol
Representative Results
Discussion
Размножение видов, размножающихся половым путем, требует образования гаплоидных гамет (т.е. яйцеклеток и сперматозоидов) посредством мейоза, которые затем объединяются при оплодотворении, восстанавливая число диплоидных хромосом и инициируя эмбриональное развитие. Ошибки в любом из этих процессов могут привести к бесплодию, эмбриональной летальности и/или врожденным дефектам. C. elegans является мощной модельной системой для изучения полового размножения. Эффекты генных мутаций или нокдауна экспрессии генов (например, РНК-интерференция) могут быть оценены относительно быстро и легко с помощью анализов эмбриональной жизнеспособности и размеров выводка, описанных выше. Мы использовали эти методы для первоначальной характеристики генов, участвующих в мейотической сегрегации хромосом и оплодотворении/активации яйцеклеток10,11,12. Наблюдаемое снижение эмбриональной жизнеспособности или размера расплода указывает на нарушение мейоза, гаметогенеза, оплодотворения или эмбриогенеза.
Поскольку эмбриональная жизнеспособность и размер расплода оцениваются относительно легко с помощью подсчета потомства и простого математического расчета, это оптимальные вводные эксперименты для новичков в исследованиях как в лаборатории, так и в классе. Легкость содержания C. elegans и экономические преимущества делают их особенно подходящими для экспериментальных уроков биологии. Студенты получают ценный исследовательский опыт в разведении C. elegans , учатся использовать препарирующие микроскопы и могут задавать биологические вопросы в системе развития, на которые можно ответить за относительно короткий промежуток времени (примерно 5 дней с протоколом, описанным в этой статье).
Сроки подсчета потомства очень важны для анализов эмбриональной жизнеспособности. При 20 ° C эмбриогенез занимает примерно 16 часов, а репродуктивно зрелые взрослые особи начинают откладывать яйца примерно через 60 часов после вылупления в виде личинок L1. Поскольку жизненный цикл быстрый, важно подсчитывать потомство в пределах соответствующего окна, оставляя достаточно времени для вылупления эмбрионов, но до того, как само потомство начнет откладывать яйца. Также важно отметить, что периоды роста варьируются в зависимости от температуры. Рост примерно в 2,1 раза быстрее при 24-25 ° C, чем 15-16 ° C, и примерно в 1,3 раза быстрее при 20 ° C, чем 15-16 ° C13. В этом протоколе мы рекомендуем, чтобы подсчет происходил через 48 часов после того, как взрослые были помещены на свежую тарелку. Этот срок гарантирует, что все эмбрионы с развитием дикого типа имеют достаточно времени для вылупления (>16 ч), но не стареют до точки репродуктивной способности. Анализы, проводимые при температурах ниже 20 ° C, возможно, потребуется продлить (перенос животных на 4 дня) для вылупления эмбрионов и для вылупленного потомства, чтобы достичь личиночной стадии, которую легче наблюдать среди бактерий на планшетах MYOB (стадии L3-L4).
Ограничением анализов эмбриональной жизнеспособности и определения размеров выводка является то, что специфический процесс развития, который нарушается, не так очевиден. Тем не менее, эти первоначальные анализы могут сопровождаться цитологическими методами, чтобы определить, какой процесс затронут. Например, вскрытие взрослых червей для высвобождения гонады с последующим окрашиванием 4′,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) и тщательный анализ морфологии ДНК внутри зародышевой линии могут выявить, нарушены ли мейотические процессы. Кроме того, окрашивание эмбрионов DAPI может выявить, на какой стадии останавливается эмбриогенез.
В заключение мы описали протокол анализа количества произведенных эмбрионов (выводка) и процента эмбрионов, жизнеспособных для различных мутантов C. elegans. Этот анализ может быть использован как для самооплодотворяющихся гермафродитов, так и для скрещивания самцов и гермафродитов. Благодаря короткому жизненному циклу C. elegans этот протокол может быть завершен менее чем за 1 неделю. Анализы эмбриональной жизнеспособности и размеры расплода могут быть использованы в качестве первого анализа генов, участвующих в мейозе, оплодотворении или эмбриональном развитии, и являются подходящими протоколами как для более продвинутых исследователей, так и для новичков в исследованиях (студентов и аспирантов первого курса).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа в лаборатории Харамильо-Ламберта поддерживается Национальным институтом здравоохранения NIGMS R35GM142524. Все штаммы C. elegans были предоставлены Генетическим центром Caenorhabditis , который финансируется Национальным институтом здравоохранения, P40 OD010440. Рисунок 1D был создан с помощью Biorender.com.
Materials
| Materials | |||
| 35 mm Petri dishes | Tritech research | T3501 | Semi-stackable, non-vented. |
| Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For MYOB |
| Bacto-Peptone | Gibco | 211677 | For MYOB |
| Cholestrol | Sigma | C8503 | For MYOB |
| Sodium Chloride | J.T. Baker | FW 58.440 | For MYOB |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | For MYOB |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253 | For MYOB |
| Strains | |||
| C. elegans wild type strain | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | |
| Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| him-5(e1490) | Caenorhabditis Genetics Center | DR466 | |
| spo-11(ok79) | Caenorhabditis Genetics Center | AV106 | |
| Equipment/software | |||
| Differential cell counter | Fischer Scientific | 02-670-12 | |
| MicroSoft Excel or Prism | MicroSoft or GraphPad | For recording and creating graphical representations of data. | |
| platinum wire | Tritech research | PT9901 | For making worm picks. 99.5% Platinum, 0.5% Iridium. This comes as 3 ft/pack, which is sufficient for making 36 worm picks (~1 inch platinum wire per pick). |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | Diascopic base with focus mount, integrated LED module, power cord, 6.7x to 50x Zoom range [WD 115 mm], Widefield Eyepiece C-15x/17 (Note: equivalent stereomicroscopes are available from other manufacturers.) |
| worm pick handle | Tritech research | TWPH1 | For making worm picks. Mount ~1 in platinum wire into worm pick handle. Alternatively, worm picks can be made by mounting platinum wire in a glass Pasteur pipette. |
References
- Hillers, K., Jantsch, V., Martinez-Perez, E., Yanowitz, J. Meiosis. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , (2017).
- O’Connor, C. Chromosomal abnormalities: aneuploidies. Nature Education. 1 (1), 172 (2008).
- Marcello, M. R., Singaravelu, G., Fertilization Singson, A. Fertilization. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 321-350 (2013).
- Marcello, M. R., Singson, A. Fertilization and the oocyte-to-embryo transition in C. elegans. BMB Reports. 43 (6), 389-399 (2010).
- Robertson, S., Lin, R. The oocyte-to-embryo transition. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 351-372 (2013).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-31 (2015).
- Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. Nondisjunction mutants of the nematode CAENORHABDITIS ELEGANS. Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).
- Chu, D. S., Shakes, D. C. Spermatogenesis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 171-203 (2013).
- Dernburg, A. F., et al. Meiotic recombination in C. elegans initiates by a conserved mechanism and is dispensable for homologous chromosome synapsis. Cell. 94 (3), 387-398 (1998).
- Bhandari, N., et al. Identification of suppressors of top-2 embryonic lethality in Caenorhabditis elegans. G3. 3 (4), 1183-1191 (2020).
- Jaramillo-Lambert, A., Fabritius, A. S., Hansen, T. J., Smith, H. E., Golden, A. The identification of a novel mutant allele of topoisomerase II in Caenorhabditis elegans reveals a unique role in chromosome segregation during spermatogenesis. Genetics. 204 (4), 1407-1422 (2016).
- Jaramillo-Lambert, A., Golden, A. The C-terminus of SPE-11 is required for proper embryonic development in C. elegans. microPublication Biology. , (2020).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).
