Caenorhabditis elegans'ta embriyonik canlılık ve yavru büyüklüğünün ölçülmesi
Summary
Burada, C. elegans model organizmasını kullanarak embriyonik canlılığı ve üretilen toplam embriyo sayısını (kuluçka) belirlemek için genel bir yöntem sunuyoruz.
Abstract
Caenorhabditis elegans , mayoz, döllenme ve embriyonik gelişim çalışmaları için mükemmel bir model organizmadır. C. elegans , büyük yavru yavruları üreten kendi kendine döllenen hermafroditler olarak bulunur – erkekler mevcut olduğunda, daha büyük çapraz soy yavruları üretebilirler. Mayoz, döllenme ve embriyogenezdeki hatalar hızla sterilitenin fenotipleri, azalmış doğurganlık veya embriyonik ölümcüllük olarak değerlendirilebilir. Bu makalede, C. elegans’ta embriyonik canlılığı ve yavru büyüklüğünü belirlemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bireysel bir Modifiye Youngren’ın, Sadece Bakto-pepton (MYOB) plakasına bir solucan toplayarak bu tahlilin nasıl kurulacağını gösteriyoruz, canlı soy ve canlı olmayan embriyoları saymak için uygun zaman dilimini oluşturuyoruz ve canlı solucan örneklerinin nasıl doğru bir şekilde sayılacağını açıklıyoruz. Bu teknik, kendi kendine döllenen hermafroditlerde canlılığı ve çiftleşme çiftleriyle çapraz döllenmeyi belirlemek için kullanılabilir. Bu nispeten basit deneyler, lisans öğrencileri ve birinci sınıf lisansüstü öğrencileri gibi yeni araştırmacılar için kolayca benimsenebilir.
Introduction
Ökaryotik organizmalarda cinsel üreme, döllenme süreci boyunca bir embriyo oluşturmak için birleşen fonksiyonel gametlerin üretimini gerektirir. Maternal ve paternal gametler, yumurta (yumurtalar) ve sperm, mayoz ve gametogenezin özelleşmiş hücre bölünmesi ve farklılaşma süreçleri yoluyla oluşturulur1. Mayoz, tek bir diploid hücre ile başlar ve orijinal ebeveyn hücrenin kromozom sayısının yarısını içeren yavru hücrelerin oluşumu ile sona erer. Ploidinin azaltılmasından, genetik materyalin bağımsız ürün çeşitliliği ve çapraz rekombinasyon yoluyla karıştırılmasına kadar, mayoz birçok önemli fonksiyona hizmet eder1. Mayoz içindeki hatalar, bir gamet içinde çok fazla veya çok az kromozom bulunan anöploidi ile sonuçlanabilir. Anöploidi insidansı insan sağlığı üzerinde muazzam etkilere sahiptir, çünkü kromozomal dengesizlikler düşüklerin ve Down sendromu ve Edwards sendromu gibi gelişimsel bozuklukların önemli bir nedenidir2.
Döllenme, anne ve baba gametlerinin yeni bir organizma oluşturmak için kaynaştığı süreçtir3. Gamet-gamet tanıma, gamet yüzeyindeki proteinler tarafından kolaylaştırılır3. Gamet uyumluluğu ile ilgili hatalar, sperm ve yumurta füzyonu ilerleyemediği için infertiliteye yol açar. Spermin bir oosit ile füzyonu, tek hücreli bir embriyodan mitotik bölünmeler yoluyla tamamen işlevsel çok hücreli bir organizmaya gelişimsel yolculuğa başlayabilen aktif bir embriyonun doğru oluşumuna yol açan bir dizi olayı tetikler4. Embriyogenez boyunca, gelişimi düzenleyen moleküler olaylar, organizmanın düzgün büyümesini sağlamak için sıkı bir şekilde düzenlenmeli ve hassas bir şekilde zamanlanmalıdır5. Erken gelişim sırasında uygun hücresel farklılaşma, organizma pluripotent bir embriyodan tam teşekküllü bir organizmaya geçerken çok önemlidir. Bu olayların karmaşıklığı nedeniyle, bozulmalar embriyonik ölümcüllükle sonuçlanan gelişimsel kusurlara yol açabilir.
Caenorhabditis elegans, mayoz, döllenme ve embriyonik gelişimi incelemek için mükemmel bir model organizmadır. C. elegans, erkek ve hermafrodit olmak üzere iki cinsiyeti olan şeffaf bir nematoddur. Kendi kendine döllenme yeteneğine sahip olan C. elegans hermafroditleri, baskın cinsiyettir 6,7. Hermafrodit gonad ilk olarak spermatheca’da depolanan dördüncü larva (L4) aşamasında sperm üretir. L4’ten yetişkinliğe geçişte, germ hattı oosit üretmeye geçer ve bunlar daha sonra depolanan sperm yoluyla döllenir. Hermafroditlerde% 0.2’den daha az bir oranda ortaya çıkan erkekler sadece sperm üretir ve hermafroditlerle çiftleşebilir. Çapraz döllenme üzerine, erkek spermi, oositlerin döllenmesinde hermafrodit spermini geride bırakır8. Bu, homozigot mutantların kendi kendine döllenen stoklar yoluyla nispeten kolay bir şekilde korunmasına ve genetik haçlar yoluyla genetik manipülasyonlara izin verir. İki cinsiyet, erkek ve dişi germ hatlarındaki mayoz arasındaki farkları araştıran çalışmalara izin verir. Ayrıca, C. elegans ve yumurtalarının şeffaf doğası nedeniyle, mayoz, gametogenez, döllenme ve embriyogenez süreçleri, floresan görüntüleme teknikleri kullanılarak canlı, sağlam hayvanlarda incelenebilir.
C. elegans’ta mayoz, döllenme ve / veya embriyonik gelişimde rol oynayabilecek genlerdeki yeni mutasyonları analiz ederken, çok önemli bir ilk adım, embriyonik canlılığı ve yavru büyüklüğünü belirlemektir, çünkü bu süreçlerdeki hatalar genellikle canlı döl üretiminde bir başarısızlığa veya azalmaya yol açar. Bu yazıda, kendi kendine döllenen hermafroditlerden veya hermafroditler ile erkekler arasındaki çaprazlardan doğurganlığı, embriyonik canlılığı ve yavru büyüklüğünü değerlendirmek için bir protokol açıklanmaktadır. Bu klasik tahlil birçok C. elegans çalışmasında kullanılmış olsa da, kurulum ve doğru niceleme için standartlaştırılmış bir protokol sunuyoruz. Bu protokolde, çiftleşme ve soy üretimine izin vermek için bireysel solucanlar veya erkek / hermafrodit çiftleri izole edilir. Döl üretimi ve canlılığı, canlı soy ve canlı olmayan embriyoların sayısını belirlemek için bir dizi gün boyunca gözlemlenir. Deneyin sonunda, embriyonik canlılık yüzdesini ve toplam yavru boyutunu hesaplamak için bireysel yavrular analiz edilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cinsel olarak üreyen türlerin çoğalması, mayoz yoluyla haploid gametlerin (yani yumurta ve sperm) oluşumunu gerektirir, bunlar daha sonra döllenmede birleştirilir, diploid kromozom sayısını geri kazandırır ve embriyonik gelişimi başlatır. Bu süreçlerden herhangi birindeki hatalar kısırlığa, embriyonik ölümcüllüğe ve / veya doğum kusurlarına yol açabilir. C. elegans, cinsel üremeyi incelemek için güçlü bir model sistemdir. Gen mutasyonlarının veya gen ekspresyonunun nakavtının (örneğin, RNA girişimi) etkileri, yukarıda açıklanan embriyonik canlılık ve yavru boyutlandırma testleri kullanılarak nispeten hızlı ve kolay bir şekilde değerlendirilebilir. Bu yöntemleri, mayotik kromozom ayrışması ve döllenme/yumurta aktivasyonu10,11,12 ile ilgili genlerin ilk karakterizasyonu için kullandık. Embriyonik canlılıkta veya yavru boyutunda gözlenen bir azalma, mayoz, gametogenez, döllenme veya embriyogenezde bir bozulma olduğunu gösterir.
Embriyonik canlılık ve yavru boyutlandırma, soy sayımı ve basit bir matematiksel hesaplama yoluyla nispeten kolay bir şekilde değerlendirildiğinden, bunlar laboratuvarda veya sınıfta araştırma acemileri için en uygun giriş deneyleridir. C. elegans yetiştiriciliğinin kolaylığı ve ekonomik avantajları, onları deneysel biyoloji dersleri için özellikle uygun hale getirmektedir. Öğrenciler C. elegans hayvancılığı yoluyla değerli araştırma deneyimi kazanırlar, diseksiyon mikroskoplarını kullanmayı öğrenirler ve gelişimsel bir sistemde nispeten kısa sürede (bu makalede açıklanan protokolle yaklaşık 5 gün) cevaplanabilecek biyolojik sorular sorabilirler.
Embriyonik canlılık testleri için soy sayımlarının zamanlaması çok önemlidir. 20 ° C’de, embriyogenez yaklaşık 16 saat sürer ve üreme açısından olgun yetişkinler, L1 larvaları olarak yumurtadan çıktıktan yaklaşık 60 saat sonra yumurta bırakmaya başlar. Yaşam döngüsü hızlı olduğu için, embriyoların yumurtadan çıkması için yeterli zamana izin veren, ancak döllerin kendileri yumurta bırakmaya başlamadan önce uygun pencerede dölleri saymak önemlidir. Büyüme dönemlerinin sıcaklığa bağlı olarak değiştiğini de belirtmek önemlidir. Büyüme, 24-25 °C’de 15-16 °C’den yaklaşık 2,1 kat daha hızlıdır ve 20 °C’de 15-16°C’den yaklaşık 1,3 kat daha hızlıdır. Bu protokolde, yetişkinler taze bir tabağa yerleştirildikten 48 saat sonra sayımların yapılmasını öneririz. Bu zaman dilimi, vahşi tip gelişime sahip tüm embriyoların yumurtadan çıkmak için yeterli zamana (>16 saat) sahip olmasını, ancak üreme kabiliyeti noktasına kadar yaşlanmamasını sağlar. 20 ° C’den düşük sıcaklıklarda yapılan testlerin, embriyoların yumurtadan çıkması ve yumurtadan çıkan döllerin MYOB plakalarındaki bakteriler arasında gözlemlenmesi daha kolay olan larva aşamalarına (L3-L4 aşamaları) ulaşması için uzatılması (4 gün boyunca hayvanları transfer etmek) gerekebilir.
Embriyonik canlılık tahlilleri ve yavru boyutlandırma ile ilgili bir sınırlama, bozulan spesifik gelişimsel sürecin kolayca belirgin olmamasıdır. Bununla birlikte, bu ilk tahliller, hangi sürecin etkilendiğini belirlemek için sitolojik tekniklerle takip edilebilir. Örneğin, gonadı serbest bırakmak için yetişkin solucanların diseksiyonu, ardından 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) boyaması ve germ hattı içindeki DNA morfolojisinin dikkatli bir şekilde analiz edilmesi, mayotik süreçlerin bozulup bozulmadığını ortaya çıkarabilir. Ek olarak, embriyoların DAPI boyaması, embriyogenezin hangi aşamada durduğunu ortaya çıkarabilir.
Sonuç olarak, üretilen embriyo sayısını (yavru) ve çeşitli C. elegans mutantları için uygun embriyoların yüzdesini belirlemek için bir protokol tanımladık. Bu tahlil hem kendi kendine döllenen hermafroditler hem de erkek / hermafrodit haçları için kullanılabilir. C. elegans’ın kısa yaşam döngüsü ile bu protokol 1 haftadan daha kısa sürede tamamlanabilir. Embriyonik canlılık testleri ve yavru boyutları, mayoz, döllenme veya embriyonik gelişimde rol oynayan genlerin ilk analizleri olarak kullanılabilir ve daha gelişmiş araştırmacılar ve araştırma acemileri (lisans ve birinci sınıf lisansüstü öğrencileri) için uygun protokollerdir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jaramillo-Lambert laboratuvarındaki çalışmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri NIGMS R35GM142524 tarafından desteklenmektedir. Tüm C. elegans suşları , Ulusal Sağlık Enstitüleri, P40 OD010440 tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetik Merkezi tarafından sağlanmıştır. Şekil 1D , Biorender.com kullanılarak oluşturulmuştur.
Materials
| Materials | |||
| 35 mm Petri dishes | Tritech research | T3501 | Semi-stackable, non-vented. |
| Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For MYOB |
| Bacto-Peptone | Gibco | 211677 | For MYOB |
| Cholestrol | Sigma | C8503 | For MYOB |
| Sodium Chloride | J.T. Baker | FW 58.440 | For MYOB |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | For MYOB |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253 | For MYOB |
| Strains | |||
| C. elegans wild type strain | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | |
| Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| him-5(e1490) | Caenorhabditis Genetics Center | DR466 | |
| spo-11(ok79) | Caenorhabditis Genetics Center | AV106 | |
| Equipment/software | |||
| Differential cell counter | Fischer Scientific | 02-670-12 | |
| MicroSoft Excel or Prism | MicroSoft or GraphPad | For recording and creating graphical representations of data. | |
| platinum wire | Tritech research | PT9901 | For making worm picks. 99.5% Platinum, 0.5% Iridium. This comes as 3 ft/pack, which is sufficient for making 36 worm picks (~1 inch platinum wire per pick). |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | Diascopic base with focus mount, integrated LED module, power cord, 6.7x to 50x Zoom range [WD 115 mm], Widefield Eyepiece C-15x/17 (Note: equivalent stereomicroscopes are available from other manufacturers.) |
| worm pick handle | Tritech research | TWPH1 | For making worm picks. Mount ~1 in platinum wire into worm pick handle. Alternatively, worm picks can be made by mounting platinum wire in a glass Pasteur pipette. |
References
- Hillers, K., Jantsch, V., Martinez-Perez, E., Yanowitz, J. Meiosis. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , (2017).
- O’Connor, C. Chromosomal abnormalities: aneuploidies. Nature Education. 1 (1), 172 (2008).
- Marcello, M. R., Singaravelu, G., Fertilization Singson, A. Fertilization. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 321-350 (2013).
- Marcello, M. R., Singson, A. Fertilization and the oocyte-to-embryo transition in C. elegans. BMB Reports. 43 (6), 389-399 (2010).
- Robertson, S., Lin, R. The oocyte-to-embryo transition. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 351-372 (2013).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-31 (2015).
- Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. Nondisjunction mutants of the nematode CAENORHABDITIS ELEGANS. Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).
- Chu, D. S., Shakes, D. C. Spermatogenesis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 171-203 (2013).
- Dernburg, A. F., et al. Meiotic recombination in C. elegans initiates by a conserved mechanism and is dispensable for homologous chromosome synapsis. Cell. 94 (3), 387-398 (1998).
- Bhandari, N., et al. Identification of suppressors of top-2 embryonic lethality in Caenorhabditis elegans. G3. 3 (4), 1183-1191 (2020).
- Jaramillo-Lambert, A., Fabritius, A. S., Hansen, T. J., Smith, H. E., Golden, A. The identification of a novel mutant allele of topoisomerase II in Caenorhabditis elegans reveals a unique role in chromosome segregation during spermatogenesis. Genetics. 204 (4), 1407-1422 (2016).
- Jaramillo-Lambert, A., Golden, A. The C-terminus of SPE-11 is required for proper embryonic development in C. elegans. microPublication Biology. , (2020).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).
