カエノラブディティス・エレガンスにおける胚の生存率とひなサイズの測定

注:このプロトコルで使用されるすべての材料の詳細については、 材料表 を参照してください。 1. 実験プレートの準備 直径35mmのペトリ皿を、改良ヨングレンダ、バクトペプトンのみ(MYOB)培地で準備します。MYOBプレートを作るには、20 gのバクト寒天培地、2 gのNaCl、0.55 gのTrizma-HCl、0.24 gのTrizma-OH、3.1 gのバクトペプトン、および1.6 mLのコレステロールを1 LのddH2Oに加え、121°Cで40分間オートクレーブします。 55°Cまで冷却し、滅菌技術を使用して、4 mLの溶融媒体を各35 mmペトリ皿に注ぎます。注:1リットルのMYOBは~250枚のプレートを作り、4°Cで最大6ヶ月間保存できます。反復ごとに最低10個体、各株に3つの反復セットを使用することをお勧めします。 滅菌技術を使用して、プレートの中央にOP50細菌の小さなスポット(約50μL)をプレートに播種します。注:小さな芝生は、小さな斑点がオスと雌雄同体の間の遭遇の増加につながり、交尾の可能性を高めるため、他家受精を評価するために特に重要です。 2.胚生存率アッセイ(雌雄同体の自家受精) 1日目各プレートの背面にラベルを付けます。実験全体を通して、各プレートとそれぞれのワームを必ず追跡してください。注:推奨されるラベリング手法-1日目:ワーム1、1日目:ワーム2、…等。 個々のL4ステージ雌雄同体を各プレートに移します。胚や他のワームがプレートに移されていないことを確認してください。ワームが成虫に成長するのを許し、20°Cの標準培養温度で24時間自家子孫を産みます。 3日目にこれらのプレートを採点します。注:実験の温度は、温度感受性変異の場合に変更することができます。温度感受性変異の場合、胚生存率アッセイは、許容温度(15〜16°C)と非許容温度(24〜26°C)の両方で実施する必要があります。 2日目新しいプレートのセットにラベルを付けます-2日目:ワーム1、2日目:ワーム2、…等。 1日目の個々のワームを新しいプレートに移します。注:これらのワームは成虫に達しているはずであり、野生型のワームはすでに胚を産み始めているはずです。 ワームに20°Cまたは他の適切な温度で24時間胚を産ませます。4日目にこれらのプレートを採点します。 3日目新しいプレートのセットにラベルを付けます。3日目:ワーム1、3日目:ワーム2、…等。 2日目の個々のワームを新しいプレートに移します。20°Cまたは他の適切な温度で24時間子孫を産むようにします。5日目にこれらのプレートを採点します。注意: 温度が低い場合は、孵化時間が長くなります。それに応じて調整してください。 細かいマーカーを使用して、35 mmの蓋にグリッドパターンを描きます。以前にカウントされたワームを追跡するために、カウント用のテストプレートの下にグリッド状の蓋を置きます(図1A-B)。差動セルカウンターを用いて、子孫の有無について1日目プレートをスコアリングする。生きている幼虫と孵化していない胚を数えます。注:この時点で、生存可能な胚が孵化するのに十分な時間が経過しています。孵化していない胚は死んでいると推定されます。 個々の正方形内で、完全に正方形内にある孵化していない胚と生きている幼虫を数えます(図1C-F)。 正方形の境界線にあるワームの場合は、ワームヘッドの位置に基づいてカウントします。頭が正方形の上端と左端に触れているワームを数えます(下端または右端に触れているワームは数えないでください。 図1D)。このアッセイでは、未受精卵母細胞をカウントしないでください(図1F)。 生きた幼虫と孵化していない胚の数を実験ノートに記録します。 4日目ステップ2.3.3.1で説明したように、生きている幼虫と孵化していない胚を数えて、2日目のプレートをスコアリングします。生きた幼虫と孵化していない胚の数を実験ノートに記録します。 5日目ステップ2.3.3.1で説明したように、生きている幼虫と孵化していない胚を数えることによって、3日目のプレートをスコアリングします。生きた幼虫と孵化していない胚の数を実験ノートに記録します。データ解析で説明した方法を用いて得られたデータを解析する。注:一部の遺伝子変異体は、生殖周期が遅れたり拡大したりすることがあります。3日目のプレートを超えて胚の継続的な産卵について個々の株を監視します。胚産生が4日目までに止まらない場合は、成虫を新しいプレートに移し続けます。 3.胚生存率アッセイ(男性/雌雄同体の他家受精) 1日目各プレートの背面にラベルを付けます。実験全体を通して、各プレートとそれぞれのワームを必ず追跡してください。 個々のL4雌雄同体ワームを各プレートに移します。胚や他のワームがプレートに移されていないことを確認してください。注:精子を産生しない fog-2 機能喪失変異体などの女性化株は、雌雄同体の代わりに使用できます。 単一のL4オスワームを、L4雌雄同体を含む各ラベル付きプレートに移します。胚や他のワームがプレートに移されていないことを確認してください。注: plg-1 バリアントオスなどの系統は、これらのオスが交尾後に雌雄同体の外陰部に交尾プラグを沈着させるため、交配が発生したかどうかを識別するために使用できます。 ワームが20°Cまたは別の適切な温度で24時間交尾して子孫を産むのを待ちます。3日目に生きた幼虫と孵化していない胚についてこれらのプレートをスコアリングします。 2日目上記の2日目のように、新しいプレートのセットにラベルを付け、ワームを転送します。この場合、雌雄同体と男性の両方を新しいプレートに移してください。雌雄同体が成人期に達したことを確認してください。 雌雄同体が20°Cまたは別の適切な温度で24時間子孫を産むのを待ちます。4日目に生きた幼虫と孵化していない胚についてこれらのプレートをスコアリングします。 3日目上記の3日目のように、新しいプレートのセットにラベルを付け、ワームを転送します。雌雄同体と男性の両方を新しいプレートに移してください。 20°Cまたは他の適切な温度で24時間子孫を産むことができます。5日目に生胚と孵化していない胚についてこれらのプレートをスコアリングします。 差動セルカウンターを使用して、ステップ2.3.3.1で説明したように、1日目のプレートから生きた幼虫と孵化していない胚を数えます。注意: プレートは4日目に必要になるため、廃棄しないでください。 生きた幼虫と孵化していない胚の数を実験ノートに記録します。 4日目ステップ2.3.3.1で説明したように、2日目のプレートから生きている子孫と孵化していない胚を数えます。生きた幼虫と孵化していない胚の数を実験ノートに記録します。 男性の1日目のプレートを確認してください。交配が起こった場合、雌雄同体と雄の予想される遺伝的比率は50:50になるはずです。1日目のプレートにオスが含まれていない場合、オスと雌雄同体の交配は発生しませんでした。この交配ペアを破棄し、この観察結果を実験ノートに記録します。 5日目ステップ2.3.3.1で説明したように、3日目のプレートから生きた幼虫と孵化していない胚を数えます。生きた幼虫と孵化していない胚の数を実験ノートに記録します。データ分析に記載されている方法を使用して得られたデータを分析します。 4.データ分析 式 (1) を使用して、株の特定の生物学的複製の胚生存率を計算します。注:生きている子孫と孵化していない胚の数は、実験期間全体の毎日の数を合計することによって得られます。(1) 親雌雄同体によって産生された子孫(孵化していない胚および幼虫)の数を合計することにより、特定の株のワームあたりのひなサイズを計算します。式 (2) を使用して平均ひなサイズを計算します。(2) 胚の生存率と平均ひなのサイズを、生物学的複製間の平均偏差と標準偏差とともに報告します。コントロールデータと実験データを比較するスチューデントの t検定を実行します。