Détection et quantification d’un peptide lié au gène de la calcitonine (CGRP) dans le plasma humain à l’aide d’un dosage immuno-enzymatique modifié
Summary
Les données publiées concernant les concentrations de peptides liés au gène de la calcitonine (CGRP) dans le plasma humain sont incohérentes. Ces incohérences peuvent être dues à l’absence d’une méthodologie standardisée et validée pour quantifier ce neuropeptide. Ici, nous décrivons un protocole validé de dosage immuno-enzymatique (ELISA) pour purifier et quantifier le CGRP dans le plasma humain.
Abstract
Le peptide lié au gène de la calcitonine (CGRP) est un neuropeptide vasoactif qui joue un rôle putatif dans la physiopathologie des migraines et peut être candidat au statut de biomarqueur. Le CGRP est libéré des fibres neuronales lors de l’activation et induit une inflammation neurogène stérile et une vasodilatation artérielle dans le système vasculaire qui reçoit l’innervation efférente du trijumeau. La présence de CGRP dans le système vasculaire périphérique a incité les recherches pour détecter et quantifier ce neuropeptide dans le plasma humain à l’aide de tests protéomiques, tels que le test immuno-enzymatique (ELISA). Cependant, sa demi-vie de 6,9 minutes et la variabilité des détails techniques des protocoles d’essai, qui ne sont souvent pas entièrement décrits, ont donné des données ELISA CGRP incohérentes dans la littérature. Ici, un protocole ELISA modifié pour la purification et la quantification du CGRP dans le plasma humain est présenté. Les étapes de la procédure comprennent la collecte et la préparation des échantillons, l’extraction à l’aide d’un sorbant polaire comme moyen de purification, des étapes supplémentaires pour bloquer la liaison non spécifique et la quantification via ELISA. De plus, le protocole a été validé avec des pics et des expériences de récupération et de linéarité des expériences de dilution. Ce protocole validé peut théoriquement être utilisé pour quantifier les concentrations de CGRP dans le plasma des personnes souffrant non seulement de migraine, mais aussi d’autres maladies dans lesquelles le CGRP peut jouer un rôle.
Introduction
Le peptide lié au gène de la calcitonine (CGRP) est un neuropeptide de 37 acides aminés présent dans les fibres neuronales avec localisation périvasculaire ainsi que dans les tissus non neuronaux. Les deux formes de CGRP, α- et β-CGRP, partagent plus de 90% d’homologie et partagent des fonctions physiologiques; cependant, l’αCGRP se trouve dans le système nerveux central et périphérique, tandis que le βCGRP se trouve dans le système nerveux entérique 1,2. Lors de l’activation des nocicepteurs et de l’exocytose dépendante du calcium, le CGRP est libéré par les neurones, induisant une inflammation neurogène stérile impliquant une vasodilatation artérielle et une extravasation des protéines plasmatiques 3,4,5,6,7. À partir de là, le CGRP apparaît dans les vaisseaux postcapillaires et peut être un biomarqueur de maladies qui provoquent une activation nociceptive afférente, telles que la migraine 8,9,10,11. Il convient de noter que le CGRP a également été impliqué dans la COVID-19 en raison de son rôle dans l’angiogenèse et la modulation immunitaire, et peut prédire une évolution défavorable de la maladie12,13. Ainsi, un protocole pour la quantification précise du CGRP dans le plasma humain pourrait avoir une grande valeur.
La plus grande attention a peut-être été accordée au rôle du CGRP dans la migraine. Sur la base d’études précliniques et cliniques, le CGRP a été proposé comme biomarqueur possible de la migraine et comme cible pour le traitement 3,4,5,6,7,8,9,10. Certaines études ont révélé une élévation du CGRP dans les cohortes souffrant de migraine épisodique par rapport aux participants témoins10,14,15. Le succès des inhibiteurs du CGRP dans les essais cliniques pour le traitement de la migraine semble impliquer un CGRP élevé comme facteur causal des migraines. Cependant, tous les chercheurs n’ont pas corroboré ces résultats16,17,18,19. De plus, le rôle du CGRP dans les symptômes de migraine autres que les maux de tête n’a pas encore été élucidé; les travaux actuels ont été motivés par le désir de comprendre le rôle du CGRP dans les symptômes vestibulaires de la migraine.
L’incohérence des données des essais immunologiques du CGRP dans la littérature pourrait être due à plusieurs raisons. Premièrement, la demi-vie du CGRP dans le système vasculaire périphérique est de 6,9 min 20, en raison de l’activité des sérines protéases 21, des enzymes dégradant l’insuline et autres métalloprotéases 22, des endopeptidases neutres 23 et de l’enzyme de conversion de l’endothéline-1 24. Deuxièmement, les détails techniques variables des immunoessais utilisés pour quantifier le CGRP ne sont pas entièrement décrits dans ces études. Enfin, le manque de standardisation de la méthodologie des immunoessais complique encore plus le tableau.
Cet article décrit un protocole ELISA (Modified Enzyme-linked immunosorbent assay) qui permet la purification et la quantification précise des α et βCGRP dans le plasma humain. Les anticorps du kit ne sont pas réactifs avec l’amyline, la calcitonine ou la substance P. Ce protocole a subi les expériences de validation nécessaires, telles que le pic et la récupération et la linéarité de la dilution, dont les données sont présentées ici. Un tel protocole ELISA du CGRP qui a fait l’objet d’une validation n’a pas encore été entièrement décrit dans la littérature. Ce protocole peut être utilisé pour quantifier le CGRP dans le plasma humain dans le contexte de la migraine ainsi que cardiologique2,25, dermatologique26, obstétrical 27, rhumatologique28,29, musculo-squelettique 30,31, endocrinien 32,33, et les maladies virales 12,13 dans lesquelles le CGRP a été impliqué.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article décrit un protocole validé permettant la détection et la quantification du CGRP dans le plasma humain. Ce protocole a été synthétisé après que les kits ELISA commerciaux du CGRP se sont avérés ne pas quantifier avec précision cette molécule. Après avoir établi un protocole de préparation des échantillons et une courbe standard valide, les pics et la récupération ainsi que la linéarité des expériences de dilution ont montré que le pourcentage de récupérations était beaucoup plus faible…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Robert N. Cole, Lauren R. DeVine et Marcos Iglesias pour leurs discussions utiles concernant ce protocole. Cela a été financé en partie par le financement de l’American Otological Society (Fellowship Grant, PSK), de l’American Hearing Research Foundation (90066548/90072266, JPC) et du National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS), une composante des National Institutes of Health (NIH), et du NIH Roadmap for Medical Research (UL1 TR003098, NSF). Le contenu de la publication relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement le point de vue officiel du TPIR Johns Hopkins, du NCATS ou des NIH.
Materials
| 1.7 mL Safeseal microcentrifuge tube | Sorenson Bioscience, Inc. | 11510 | |
| 99% methanol | ThermoFisher Scientific | L13255.0F | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 14-959-49B | |
| 2 mL round bottom sterile cryovials | CRYO.S | 122263 | |
| 4% acetic acid | ThermoFisher Scientific | 035572.K2 | |
| 6.0 mL Vacutainer EDTA collection tube | BD | 367863 | |
| Allegra 64R benchtop centrifuge | Beckman Coulter, Inc. | 367586 | |
| Aprotinin | VWR | 76344-814 | |
| CGRP (human) ELISA kit | Bertin Bioreagent | A05481 | |
| CGRP stock | Bertin Bioreagent | ||
| EIA Buffer | Bertin Bioreagent | A07000 | |
| Ellman's Reagent | Bertin Bioreagent | A09000_49+1 | |
| Multichannel pipettes | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
| Oasis HLB 3 cc Vac Cartridges | Waters | WAT094226 | |
| Orbital Shaker | Bellco | 7744-01010 | |
| Precision micropipettes | ThermoFisher Scientific | F144055MG | |
| SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate reader | Molecular Devices | Part Number M2 | |
| TBS/Fish Gelatin | Bioworld, from Fischer Scientific | 50-199-167 | |
| Ultrapure water ELISA Grade | Bertin Bioreagent | A07001 | |
| Vacufuge plus – Centrifuge Concentrator | Eppendorf | 22820109 | |
| Wash Buffer | Bertin Bioreagent | A17000 |
References
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. -. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Brain, S. D., Grant, A. D. Vascular actions of calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin. Physiological Reviews. 84 (3), 903-934 (2004).
- Edvinsson, L., Ekman, R., Jansen, I., McCulloch, J., Uddman, R. Calcitonin gene-related peptide and cerebral blood vessels: distribution and vasomotor effects. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 7 (6), 720-728 (1987).
- Donnerer, J., Stein, C. Evidence for an increase in the release of CGRP from sensory nerves during inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 657, 505-506 (1992).
- Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Release of vasoactive peptides in the extracerebral circulation of humans and the cat during activation of the trigeminovascular system. Annals of Neurology. 23 (2), 193-196 (1988).
- Markowitz, S., Saito, K., Moskowitz, M. A. Neurogenically mediated leakage of plasma protein occurs from blood vessels in dura mater but not brain. The Journal of Neuroscience. 7 (12), 4129-4136 (1987).
- Saito, K., Markowitz, S., Moskowitz, M. A. Ergot alkaloids block neurogenic extravasation in dura mater: proposed action in vascular headaches. Annals of Neurology. 24 (6), 732-737 (1988).
- Lassen, L. H., et al. CGRP may play a causative role in migraine. Cephalalgia. 22 (1), 54-61 (2002).
- Cady, R. K., Vause, C. V., Ho, T. W., Bigal, M. E., Durham, P. L. Elevated saliva calcitonin gene-related peptide levels during acute migraine predict therapeutic response to rizatriptan. Headache. 49 (9), 1258-1266 (2009).
- Cernuda-Morollón, E., et al. Interictal increase of CGRP levels in peripheral blood as a biomarker for chronic migraine. Neurology. 81 (14), 1191-1196 (2013).
- Messlinger, K. The big CGRP flood-sources, sinks and signalling sites in the trigeminovascular system. The Journal of Headache and Pain. 19, 22 (2018).
- Ochoa-Callejero, L., et al. Circulating levels of calcitonin gene-related peptide are lower in COVID-19 patients. Journal of the Endocrine Society. 5 (3), (2021).
- Rizzi, M., et al. CGRP plasma levels correlate with the clinical evolution and prognosis of hospitalized acute COVID-19 patients. Viruses. 14 (10), 2123 (2022).
- Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache. Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).
- Sarchielli, P., et al. Clinical-biochemical correlates of migraine attacks in rizatriptan responders and non-responders. Cephalalgia. 26 (3), 257-265 (2006).
- Greco, R., et al. Plasma levels of CGRP and expression of specific microRNAs in blood cells of episodic and chronic migraine subjects: towards the identification of a panel of peripheral biomarkers of migraine. The Journal of Headache and Pain. 21 (1), 122 (2020).
- Tvedskov, J. F., et al. No increase of calcitonin gene-related peptide in jugular blood during migraine. Annals of Neurology. 58 (4), 561-568 (2005).
- Pellesi, L., et al. Plasma levels of CGRP during a 2-h infusion of VIP in healthy volunteers and patients with migraine: An exploratory study. Frontiers in Neurology. 13, 871176 (2022).
- Kruuse, C., Iversen, H. K., Jansen-Olesen, I., Edvinsson, L., Olesen, J. Calcitonin gene-related peptide (CGRP) levels during glyceryl trinitrate (GTN)-induced headache in healthy volunteers. Cephalalgia. 30 (4), 467-474 (2010).
- Kraenzlin, M. E., Ch’ng, J. L., Mulderry, P. K., Ghatei, M. A., Bloom, S. R. Infusion of a novel peptide, calcitonin gene-related peptide (CGRP) in man. Pharmacokinetics and effects on gastric acid secretion and on gastrointestinal hormones. Regulatory Peptides. 10 (2-3), 189-197 (1985).
- Brain, S. D., Williams, T. J. Substance P regulates the vasodilator activity of calcitonin gene-related peptide. Nature. 335 (6185), 73-75 (1988).
- Kim, Y. -. G., Lone, A. M., Nolte, W. M., Saghatelian, A. Peptidomics approach to elucidate the proteolytic regulation of bioactive peptides. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (22), 8523-8527 (2012).
- Katayama, M., et al. Catabolism of calcitonin gene-related peptide and substance P by neutral endopeptidase. Peptides. 12 (3), 563-567 (1991).
- Hartopo, A. B., et al. Endothelin-converting enzyme-1 gene ablation attenuates pulmonary fibrosis via CGRP-cAMP/EPAC1 pathway. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 48 (4), 465-476 (2013).
- Mair, J., et al. Plasma CGRP in acute myocardial infarction. Lancet. 335 (8682), 168 (1990).
- Antúnez, C., et al. Calcitonin gene-related peptide modulates interleukin-13 in circulating cutaneous lymphocyte-associated antigen-positive T cells in patients with atopic dermatitis. The British Journal of Dermatology. 161 (3), 547-553 (2009).
- Gangula, P. R., et al. Pregnancy and steroid hormones enhance the vasodilation responses to CGRP in rats. The American Journal of Physiology. 276 (1), H284-H288 (1999).
- Hernanz, A., Medina, S., de Miguel, E., Martín-Mola, E. Effect of calcitonin gene-related peptide, neuropeptide Y, substance P, and vasoactive intestinal peptide on interleukin-1beta, interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha production by peripheral whole blood cells from rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients. Regulatory Peptides. 115 (1), 19-24 (2003).
- Takeba, Y., Suzuki, N., Kaneko, A., Asai, T., Sakane, T. Evidence for neural regulation of inflammatory synovial cell functions by secreting calcitonin gene-related peptide and vasoactive intestinal peptide in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism. 42 (11), 2418-2429 (1999).
- Ahmed, M., Srinivasan, G. R., Theodorsson, E., Schultzberg, M., Kreicbergs, A. Effects of surgical denervation on substance P and calcitonin gene-related peptide in adjuvant arthritis. Peptides. 16 (4), 569-579 (1995).
- Neugebauer, V., Rümenapp, P., Schaible, H. G. Calcitonin gene-related peptide is involved in the spinal processing of mechanosensory input from the rat’s knee joint and in the generation and maintenance of hyperexcitability of dorsal horn-neurons during development of acute inflammation. Neuroscience. 71 (4), 1095-1109 (1996).
- Wang, L. H., et al. Serum levels of calcitonin gene-related peptide and substance P are decreased in patients with diabetes mellitus and coronary artery disease. The Journal of International Medical Research. 40 (1), 134-140 (2012).
- Zelissen, P. M., Koppeschaar, H. P., Lips, C. J., Hackeng, W. H. Calcitonin gene-related peptide in human obesity. Peptides. 12 (4), 861-863 (1991).
- World Health Organization. WHO Guidelines on Drawing Blood: Best Practices in Phlebotomy. 3, Blood-sampling systems. World Health Organization. , (2010).
- Raffaelli, B., et al. Plasma calcitonin gene-related peptide (CGRP) in migraine and endometriosis during the menstrual cycle. Annals of Clinical and Translational Neurology. 8 (6), 1251-1259 (2021).
- Andreasson, U., et al. A practical guide to immunoassay method validation. Frontiers in Neurology. 6, 179 (2015).
- Messlinger, K., et al. CGRP measurements in human plasma-a methodological study. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 41 (13), 1359-1373 (2021).
- Sakamoto, S., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. Journal of Natural Medicines. 72 (1), 32-42 (2018).
- Lee, J. -. E., Kim, S. Y., Shin, S. -. Y. Effect of repeated freezing and thawing on biomarker stability in plasma and serum samples. Osong Public Health and Research Perspectives. 6 (6), 357-362 (2015).
- Fan, P. -. C., Kuo, P. -. H., Lee, M. T., Chang, S. -. H., Chiou, L. -. C. Plasma calcitonin gene-related peptide: A potential biomarker for diagnosis and therapeutic responses in pediatric migraine. Frontiers in Neurology. 10, 10 (2019).
- Raffaelli, B., et al. Change of CGRP plasma concentrations in migraine after discontinuation of CGRP-(receptor) monoclonal antibodies. Pharmaceutics. 15 (1), 293 (2023).
