Detectie en kwantificering van calcitonine gen-gerelateerd peptide (CGRP) in menselijk plasma met behulp van een gemodificeerde enzymgebonden immunosorbent assay
Summary
Gepubliceerde gegevens met betrekking tot calcitonine gen-gerelateerde peptide (CGRP) concentraties in menselijk plasma zijn inconsistent. Deze inconsistenties kunnen te wijten zijn aan het ontbreken van een gestandaardiseerde, gevalideerde methodologie om dit neuropeptide te kwantificeren. Hier beschrijven we een gevalideerd enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) protocol om CGRP in menselijk plasma te zuiveren en te kwantificeren.
Abstract
Calcitonine gen-gerelateerd peptide (CGRP) is een vasoactief neuropeptide dat een vermeende rol speelt in de pathofysiologie van migraine en kan een kandidaat zijn voor de status van biomarker. CGRP komt vrij uit neuronale vezels bij activering en induceert steriele neurogene ontsteking en arteriële vaatverwijding in de vasculatuur die trigeminus efferente innervatie ontvangt. De aanwezigheid van CGRP in de perifere vasculatuur heeft geleid tot onderzoek om dit neuropeptide in menselijk plasma te detecteren en te kwantificeren met behulp van proteomische assays, zoals de enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). De halfwaardetijd van 6,9 min en de variabiliteit in technische details van testprotocollen, die vaak niet volledig worden beschreven, hebben echter inconsistente CGRP ELISA-gegevens in de literatuur opgeleverd. Hier wordt een aangepast ELISA-protocol voor de zuivering en kwantificering van CGRP in menselijk plasma gepresenteerd. De procedurele stappen omvatten monsterverzameling en -bereiding, extractie met behulp van een polair sorptiemiddel als zuiveringsmiddel, aanvullende stappen om niet-specifieke binding te blokkeren en kwantificering via ELISA. Verder is het protocol gevalideerd met spike en herstel en lineariteit van verdunningsexperimenten. Dit gevalideerde protocol kan theoretisch worden gebruikt om CGRP-concentraties in het plasma van personen te kwantificeren, niet alleen met migraine, maar ook met andere ziekten waarbij CGRP een rol kan spelen.
Introduction
Calcitonine gen-gerelateerd peptide (CGRP) is een 37-aminozuur neuropeptide dat aanwezig is in neuronale vezels met perivasculaire lokalisatie en niet-neuronale weefsels. De twee vormen van CGRP, α- en β-CGRP, delen meer dan 90% homologie en delen fysiologische functies; αCGRP wordt echter aangetroffen in het centrale en perifere zenuwstelsel, terwijl βCGRP wordt aangetroffen in het enterische zenuwstelsel 1,2. Bij activering van nociceptoren en calciumafhankelijke exocytose komt CGRP vrij uit neuronen, waardoor steriele neurogene ontsteking met arteriële vasodilatatie en plasma-eiwitextravasatie wordt geïnduceerd 3,4,5,6,7. Vanaf hier verschijnt CGRP in de postcapillaire vaten en kan het een biomarker zijn voor ziekten die afferente nociceptieve activering veroorzaken, zoals migraine 8,9,10,11. Van belang is dat CGRP ook betrokken is bij COVID-19 door zijn rol in angiogenese en immuunmodulatie, en kan een ongunstige ziekte-evolutie voorspellen12,13. Een protocol voor de nauwkeurige kwantificering van CGRP in menselijk plasma zou dus een brede waarde kunnen hebben.
De meeste aandacht is misschien wel besteed aan de rol van CGRP bij migraine. Op basis van preklinische en klinische studies is CGRP naar voren gebracht als een mogelijke biomarker voor migraine en als een doelwit voor behandeling 3,4,5,6,7,8,9,10. Sommige studies hebben een verhoging van CGRP gevonden in cohorten met episodische migraine ten opzichte van controledeelnemers10,14,15. Het succes van CGRP-remmers in klinische onderzoeken voor de behandeling van migrainehoofdpijn lijkt verhoogde CGRP te impliceren als een oorzakelijke factor voor migrainehoofdpijn. Niet alle onderzoekers hebben deze resultaten echter bevestigd16,17,18,19. Bovendien moet de rol van CGRP bij niet-hoofdpijnsymptomen van migraine nog worden opgehelderd; het huidige werk werd gemotiveerd door een verlangen om de rol van CGRP bij vestibulaire symptomen van migraine te begrijpen.
Inconsistente CGRP-immunoassaygegevens in de literatuur kunnen verschillende oorzaken hebben. Ten eerste is de halfwaardetijd van CGRP in de perifere vasculatuur 6,9 min 20, vanwege de activiteit van serineproteasen 21, insulineafbrekende enzymen en andere metalloproteasen 22, neutrale endopeptidasen 23 en endotheline-converterend enzym-1 24. Ten tweede worden de variabele technische details van de immunoassays die worden gebruikt om CGRP te kwantificeren niet volledig beschreven in dergelijke studies. Ten slotte compliceert het gebrek aan standaardisatie van de immunoassay-methodologie het beeld nog meer.
Dit artikel beschrijft een gemodificeerd enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) protocol dat de zuivering en nauwkeurige kwantificering van α- en βCGRP in menselijk plasma mogelijk maakt. De antilichamen van de kit zijn niet kruisreactief met amyline, calcitonine of stof P. Dit protocol heeft de nodige validatie-experimenten ondergaan, zoals spike en herstel en lineariteit van verdunning, waarvan de gegevens hier worden gepresenteerd. Zo’n CGRP ELISA-protocol dat validatie heeft ondergaan, is nog niet eerder volledig beschreven in de literatuur. Dit protocol kan worden gebruikt om CGRP in menselijk plasma te kwantificeren in de context van migraine, evenals cardiologische2,25, dermatologische 26, verloskundige 27, reumatologische28,29, musculoskeletale 30,31, endocriene 32,33 en virale ziekten 12,13 waarbij CGRP betrokken is geweest.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel beschrijft een gevalideerd protocol dat de detectie en kwantificering van CGRP in menselijk plasma mogelijk maakt. Dit protocol werd gesynthetiseerd nadat commerciële CGRP ELISA-kits dit molecuul niet nauwkeurig bleken te kwantificeren. Na het vaststellen van een monstervoorbereidingsprotocol en een geldige standaardcurve, toonden spike- en herstel- en lineariteitsexperimenten aan dat het percentage terugvorderingen veel lager was dan verwacht. Vergelijkbare resultaten werden gevonden met behulp van een ande…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Robert N. Cole, Lauren R. DeVine en Marcos Iglesias bedanken voor hun nuttige discussies over dit protocol. Dit werd gedeeltelijk ondersteund door financiering van de American Otological Society (Fellowship Grant, PSK), de American Hearing Research Foundation (90066548 / 90072266, JPC) en het National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS), een onderdeel van de National Institutes of Health (NIH) en NIH Roadmap for Medical Research (UL1 TR003098, NSF). De inhoud van de publicatie is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de Johns Hopkins ICTR, NCATS of NIH.
Materials
| 1.7 mL Safeseal microcentrifuge tube | Sorenson Bioscience, Inc. | 11510 | |
| 99% methanol | ThermoFisher Scientific | L13255.0F | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 14-959-49B | |
| 2 mL round bottom sterile cryovials | CRYO.S | 122263 | |
| 4% acetic acid | ThermoFisher Scientific | 035572.K2 | |
| 6.0 mL Vacutainer EDTA collection tube | BD | 367863 | |
| Allegra 64R benchtop centrifuge | Beckman Coulter, Inc. | 367586 | |
| Aprotinin | VWR | 76344-814 | |
| CGRP (human) ELISA kit | Bertin Bioreagent | A05481 | |
| CGRP stock | Bertin Bioreagent | ||
| EIA Buffer | Bertin Bioreagent | A07000 | |
| Ellman's Reagent | Bertin Bioreagent | A09000_49+1 | |
| Multichannel pipettes | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
| Oasis HLB 3 cc Vac Cartridges | Waters | WAT094226 | |
| Orbital Shaker | Bellco | 7744-01010 | |
| Precision micropipettes | ThermoFisher Scientific | F144055MG | |
| SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate reader | Molecular Devices | Part Number M2 | |
| TBS/Fish Gelatin | Bioworld, from Fischer Scientific | 50-199-167 | |
| Ultrapure water ELISA Grade | Bertin Bioreagent | A07001 | |
| Vacufuge plus – Centrifuge Concentrator | Eppendorf | 22820109 | |
| Wash Buffer | Bertin Bioreagent | A17000 |
References
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. -. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Brain, S. D., Grant, A. D. Vascular actions of calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin. Physiological Reviews. 84 (3), 903-934 (2004).
- Edvinsson, L., Ekman, R., Jansen, I., McCulloch, J., Uddman, R. Calcitonin gene-related peptide and cerebral blood vessels: distribution and vasomotor effects. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 7 (6), 720-728 (1987).
- Donnerer, J., Stein, C. Evidence for an increase in the release of CGRP from sensory nerves during inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 657, 505-506 (1992).
- Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Release of vasoactive peptides in the extracerebral circulation of humans and the cat during activation of the trigeminovascular system. Annals of Neurology. 23 (2), 193-196 (1988).
- Markowitz, S., Saito, K., Moskowitz, M. A. Neurogenically mediated leakage of plasma protein occurs from blood vessels in dura mater but not brain. The Journal of Neuroscience. 7 (12), 4129-4136 (1987).
- Saito, K., Markowitz, S., Moskowitz, M. A. Ergot alkaloids block neurogenic extravasation in dura mater: proposed action in vascular headaches. Annals of Neurology. 24 (6), 732-737 (1988).
- Lassen, L. H., et al. CGRP may play a causative role in migraine. Cephalalgia. 22 (1), 54-61 (2002).
- Cady, R. K., Vause, C. V., Ho, T. W., Bigal, M. E., Durham, P. L. Elevated saliva calcitonin gene-related peptide levels during acute migraine predict therapeutic response to rizatriptan. Headache. 49 (9), 1258-1266 (2009).
- Cernuda-Morollón, E., et al. Interictal increase of CGRP levels in peripheral blood as a biomarker for chronic migraine. Neurology. 81 (14), 1191-1196 (2013).
- Messlinger, K. The big CGRP flood-sources, sinks and signalling sites in the trigeminovascular system. The Journal of Headache and Pain. 19, 22 (2018).
- Ochoa-Callejero, L., et al. Circulating levels of calcitonin gene-related peptide are lower in COVID-19 patients. Journal of the Endocrine Society. 5 (3), (2021).
- Rizzi, M., et al. CGRP plasma levels correlate with the clinical evolution and prognosis of hospitalized acute COVID-19 patients. Viruses. 14 (10), 2123 (2022).
- Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache. Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).
- Sarchielli, P., et al. Clinical-biochemical correlates of migraine attacks in rizatriptan responders and non-responders. Cephalalgia. 26 (3), 257-265 (2006).
- Greco, R., et al. Plasma levels of CGRP and expression of specific microRNAs in blood cells of episodic and chronic migraine subjects: towards the identification of a panel of peripheral biomarkers of migraine. The Journal of Headache and Pain. 21 (1), 122 (2020).
- Tvedskov, J. F., et al. No increase of calcitonin gene-related peptide in jugular blood during migraine. Annals of Neurology. 58 (4), 561-568 (2005).
- Pellesi, L., et al. Plasma levels of CGRP during a 2-h infusion of VIP in healthy volunteers and patients with migraine: An exploratory study. Frontiers in Neurology. 13, 871176 (2022).
- Kruuse, C., Iversen, H. K., Jansen-Olesen, I., Edvinsson, L., Olesen, J. Calcitonin gene-related peptide (CGRP) levels during glyceryl trinitrate (GTN)-induced headache in healthy volunteers. Cephalalgia. 30 (4), 467-474 (2010).
- Kraenzlin, M. E., Ch’ng, J. L., Mulderry, P. K., Ghatei, M. A., Bloom, S. R. Infusion of a novel peptide, calcitonin gene-related peptide (CGRP) in man. Pharmacokinetics and effects on gastric acid secretion and on gastrointestinal hormones. Regulatory Peptides. 10 (2-3), 189-197 (1985).
- Brain, S. D., Williams, T. J. Substance P regulates the vasodilator activity of calcitonin gene-related peptide. Nature. 335 (6185), 73-75 (1988).
- Kim, Y. -. G., Lone, A. M., Nolte, W. M., Saghatelian, A. Peptidomics approach to elucidate the proteolytic regulation of bioactive peptides. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (22), 8523-8527 (2012).
- Katayama, M., et al. Catabolism of calcitonin gene-related peptide and substance P by neutral endopeptidase. Peptides. 12 (3), 563-567 (1991).
- Hartopo, A. B., et al. Endothelin-converting enzyme-1 gene ablation attenuates pulmonary fibrosis via CGRP-cAMP/EPAC1 pathway. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 48 (4), 465-476 (2013).
- Mair, J., et al. Plasma CGRP in acute myocardial infarction. Lancet. 335 (8682), 168 (1990).
- Antúnez, C., et al. Calcitonin gene-related peptide modulates interleukin-13 in circulating cutaneous lymphocyte-associated antigen-positive T cells in patients with atopic dermatitis. The British Journal of Dermatology. 161 (3), 547-553 (2009).
- Gangula, P. R., et al. Pregnancy and steroid hormones enhance the vasodilation responses to CGRP in rats. The American Journal of Physiology. 276 (1), H284-H288 (1999).
- Hernanz, A., Medina, S., de Miguel, E., Martín-Mola, E. Effect of calcitonin gene-related peptide, neuropeptide Y, substance P, and vasoactive intestinal peptide on interleukin-1beta, interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha production by peripheral whole blood cells from rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients. Regulatory Peptides. 115 (1), 19-24 (2003).
- Takeba, Y., Suzuki, N., Kaneko, A., Asai, T., Sakane, T. Evidence for neural regulation of inflammatory synovial cell functions by secreting calcitonin gene-related peptide and vasoactive intestinal peptide in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism. 42 (11), 2418-2429 (1999).
- Ahmed, M., Srinivasan, G. R., Theodorsson, E., Schultzberg, M., Kreicbergs, A. Effects of surgical denervation on substance P and calcitonin gene-related peptide in adjuvant arthritis. Peptides. 16 (4), 569-579 (1995).
- Neugebauer, V., Rümenapp, P., Schaible, H. G. Calcitonin gene-related peptide is involved in the spinal processing of mechanosensory input from the rat’s knee joint and in the generation and maintenance of hyperexcitability of dorsal horn-neurons during development of acute inflammation. Neuroscience. 71 (4), 1095-1109 (1996).
- Wang, L. H., et al. Serum levels of calcitonin gene-related peptide and substance P are decreased in patients with diabetes mellitus and coronary artery disease. The Journal of International Medical Research. 40 (1), 134-140 (2012).
- Zelissen, P. M., Koppeschaar, H. P., Lips, C. J., Hackeng, W. H. Calcitonin gene-related peptide in human obesity. Peptides. 12 (4), 861-863 (1991).
- World Health Organization. WHO Guidelines on Drawing Blood: Best Practices in Phlebotomy. 3, Blood-sampling systems. World Health Organization. , (2010).
- Raffaelli, B., et al. Plasma calcitonin gene-related peptide (CGRP) in migraine and endometriosis during the menstrual cycle. Annals of Clinical and Translational Neurology. 8 (6), 1251-1259 (2021).
- Andreasson, U., et al. A practical guide to immunoassay method validation. Frontiers in Neurology. 6, 179 (2015).
- Messlinger, K., et al. CGRP measurements in human plasma-a methodological study. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 41 (13), 1359-1373 (2021).
- Sakamoto, S., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. Journal of Natural Medicines. 72 (1), 32-42 (2018).
- Lee, J. -. E., Kim, S. Y., Shin, S. -. Y. Effect of repeated freezing and thawing on biomarker stability in plasma and serum samples. Osong Public Health and Research Perspectives. 6 (6), 357-362 (2015).
- Fan, P. -. C., Kuo, P. -. H., Lee, M. T., Chang, S. -. H., Chiou, L. -. C. Plasma calcitonin gene-related peptide: A potential biomarker for diagnosis and therapeutic responses in pediatric migraine. Frontiers in Neurology. 10, 10 (2019).
- Raffaelli, B., et al. Change of CGRP plasma concentrations in migraine after discontinuation of CGRP-(receptor) monoclonal antibodies. Pharmaceutics. 15 (1), 293 (2023).
