Modifiye Enzime Bağlı İmmünosorbent Testi Kullanılarak İnsan Plazmasında Kalsitonin Geniyle İlgili Peptidin (CGRP) Tespiti ve Miktarının Belirlenmesi
Summary
İnsan plazmasındaki kalsitonin gen ilişkili peptid (CGRP) konsantrasyonları ile ilgili yayınlanmış veriler tutarsızdır. Bu tutarsızlıklar, bu nöropeptidi ölçmek için standartlaştırılmış, doğrulanmış bir metodolojinin eksikliğinden kaynaklanıyor olabilir. Burada, insan plazmasındaki CGRP’yi saflaştırmak ve ölçmek için doğrulanmış bir enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) protokolünü açıklıyoruz.
Abstract
Kalsitonin geni ile ilişkili peptid (CGRP), migren baş ağrılarının patofizyolojisinde varsayılan bir rol oynayan ve biyobelirteç statüsü için aday olabilen vazoaktif bir nöropeptittir. CGRP, aktivasyon üzerine nöronal liflerden salınır ve trigeminal efferent innervasyon alan vaskülatürde steril nörojenik inflamasyon ve arteriyel vazodilatasyonu indükler. Periferik vaskülatüründe CGRP’nin varlığı, enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) gibi proteomik tahliller kullanarak insan plazmasında bu nöropeptidi tespit etmek ve ölçmek için araştırmaları teşvik etmiştir. Bununla birlikte, 6.9 dakikalık yarılanma ömrü ve genellikle tam olarak tanımlanamayan tahlil protokollerinin teknik detaylarındaki değişkenlik, literatürde tutarsız CGRP ELISA verileri vermiştir. Burada, insan plazmasında CGRP’nin saflaştırılması ve nicelleştirilmesi için modifiye edilmiş bir ELISA protokolü sunulmaktadır. Prosedürel adımlar, numune toplama ve hazırlama, saflaştırma aracı olarak polar sorbent kullanarak ekstraksiyon, spesifik olmayan bağlanmayı engellemek için ek adımlar ve ELISA yoluyla nicelleştirmeyi içerir. Ayrıca, protokol spike ve geri kazanım ve seyreltme deneylerinin doğrusallığı ile doğrulanmıştır. Bu doğrulanmış protokol teorik olarak sadece migren ile değil, aynı zamanda CGRP’nin rol oynayabileceği diğer hastalıklarla da bireylerin plazmasındaki CGRP konsantrasyonlarını ölçmek için kullanılabilir.
Introduction
Kalsitonin geni ile ilişkili peptid (CGRP), perivasküler lokalizasyonu olan nöronal liflerde ve nöronal olmayan dokularda bulunan 37 amino asitlik bir nöropeptittir. CGRP’nin iki formu, α- ve β-CGRP,% 90’dan fazla homolojiyi paylaşır ve fizyolojik fonksiyonları paylaşır; Bununla birlikte, αCGRP merkezi ve periferik sinir sisteminde, βCGRP ise enterik sinir sisteminde bulunur 1,2. Nosiseptör aktivasyonu ve kalsiyuma bağımlı ekzositoz üzerine, CGRP nöronlardan salınır ve arteriyel vazodilatasyon ve plazma protein ekstravazasyonunu içeren steril nörojenik inflamasyonu indükler 3,4,5,6,7. Buradan, CGRP postkapiller damarlarda görülür ve migren 8,9,10,11 gibi afferent nosiseptif aktivasyona neden olan hastalıklar için bir biyobelirteç olabilir. CGRP, anjiyogenez ve immün modülasyondaki rolü nedeniyle COVID-19’a da dahil edilmiştir ve olumsuz hastalık evrimini öngörebilir12,13. Bu nedenle, insan plazmasında CGRP’nin doğru bir şekilde ölçülmesi için bir protokol geniş bir değere sahip olabilir.
Belki de en çok dikkat CGRP’nin migrendeki rolüne verilmiştir. Preklinik ve klinik çalışmalara dayanarak, CGRP migren için olası bir biyobelirteç ve tedavi için bir hedef olarak ortaya konmuştur 3,4,5,6,7,8,9,10. Bazı çalışmalar, kontrol katılımcılarına göre epizodik migreni olan kohortlarda CGRP yüksekliği bulmuştur10,14,15. CGRP inhibitörlerinin migren baş ağrısı tedavisi için klinik çalışmalardaki başarısı, migren baş ağrıları için nedensel bir faktör olarak yüksek CGRP’yi ima ediyor gibi görünmektedir. Bununla birlikte, tüm araştırmacılar bu sonuçları doğrulamamıştır16,17,18,19. Ayrıca, CGRP’nin migrenin baş ağrısı olmayan semptomlarındaki rolü henüz aydınlatılmamıştır; Mevcut çalışma, migrenin vestibüler semptomlarında CGRP’nin rolünü anlama arzusuyla motive edildi.
Literatürdeki tutarsız CGRP immünoassay verileri çeşitli nedenlere bağlı olabilir. İlk olarak, CGRP’nin periferik vaskülatürdeki yarı ömrü, serin proteazlar 21, insülin parçalayıcı enzimler ve diğer metaloproteazlar 22, nötral endopeptidazlar23 ve endotelin dönüştürücü enzim-124’ün aktivitesi nedeniyle 6.9 dakika 20’dir. İkincisi, CGRP’yi ölçmek için kullanılan immünoassayların değişken teknik detayları bu tür çalışmalarda tam olarak tanımlanmamıştır. Son olarak, immünoassay metodolojisinin standardizasyon eksikliği resmi daha da karmaşıklaştırmaktadır.
Bu makalede, insan plazmasında α- ve βCGRP’nin saflaştırılmasına ve doğru bir şekilde nicelleştirilmesine izin veren modifiye enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) protokolü açıklanmaktadır. Kitin antikorları amilin, kalsitonin veya P maddesi ile çapraz reaktif değildir. Bu protokol, verileri burada sunulan ani artış ve geri kazanım ve seyreltmenin doğrusallığı gibi gerekli doğrulama deneylerinden geçmiştir. Validasyondan geçen böyle bir CGRP ELISA protokolü daha önce literatürde tam olarak tanımlanmamıştır. Bu protokol, migrenin yanı sıra kardiyolojik 2,25, dermatolojik26, obstetrik 27, romatolojik28,29, kas-iskelet sistemi30,31, endokrin 32,33 ve CGRP’nin ilişkili olduğu viral hastalıklar12,13 bağlamında insan plazmasındaki CGRP’yi ölçmek için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede, insan plazmasında CGRP’nin tespitine ve miktarına izin veren doğrulanmış bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokol, ticari CGRP ELISA kitlerinin bu molekülü doğru bir şekilde ölçmediği tespit edildikten sonra sentezlendi. Bir numune hazırlama protokolü ve geçerli bir standart eğri oluşturduktan sonra, spike ve geri kazanım ve seyreltme deneylerinin doğrusallığı, iyileşme yüzdesinin beklenenden çok daha düşük olduğunu göstermiştir. Farklı bir ticari CGRP ELISA kiti kullanıl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Robert N. Cole, Lauren R. DeVine ve Marcos Iglesias’a bu protokolle ilgili yararlı tartışmaları için teşekkür ederiz. Bu kısmen Amerikan Otoloji Derneği (Fellowship Grant, PSK), Amerikan İşitme Araştırma Vakfı (90066548/90072266, JPC) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri’nin (NIH) bir bileşeni olan Ulusal Translasyonel Bilimleri Geliştirme Merkezi (NCATS) ve NIH Tıbbi Araştırma Yol Haritası (UL1 TR003098, NSF) tarafından finanse edilerek desteklenmiştir. Yayının içeriği yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Johns Hopkins ICTR, NCATS veya NIH’nin resmi görüşünü temsil etmek zorunda değildir.
Materials
| 1.7 mL Safeseal microcentrifuge tube | Sorenson Bioscience, Inc. | 11510 | |
| 99% methanol | ThermoFisher Scientific | L13255.0F | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 14-959-49B | |
| 2 mL round bottom sterile cryovials | CRYO.S | 122263 | |
| 4% acetic acid | ThermoFisher Scientific | 035572.K2 | |
| 6.0 mL Vacutainer EDTA collection tube | BD | 367863 | |
| Allegra 64R benchtop centrifuge | Beckman Coulter, Inc. | 367586 | |
| Aprotinin | VWR | 76344-814 | |
| CGRP (human) ELISA kit | Bertin Bioreagent | A05481 | |
| CGRP stock | Bertin Bioreagent | ||
| EIA Buffer | Bertin Bioreagent | A07000 | |
| Ellman's Reagent | Bertin Bioreagent | A09000_49+1 | |
| Multichannel pipettes | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
| Oasis HLB 3 cc Vac Cartridges | Waters | WAT094226 | |
| Orbital Shaker | Bellco | 7744-01010 | |
| Precision micropipettes | ThermoFisher Scientific | F144055MG | |
| SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate reader | Molecular Devices | Part Number M2 | |
| TBS/Fish Gelatin | Bioworld, from Fischer Scientific | 50-199-167 | |
| Ultrapure water ELISA Grade | Bertin Bioreagent | A07001 | |
| Vacufuge plus – Centrifuge Concentrator | Eppendorf | 22820109 | |
| Wash Buffer | Bertin Bioreagent | A17000 |
References
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. -. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Brain, S. D., Grant, A. D. Vascular actions of calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin. Physiological Reviews. 84 (3), 903-934 (2004).
- Edvinsson, L., Ekman, R., Jansen, I., McCulloch, J., Uddman, R. Calcitonin gene-related peptide and cerebral blood vessels: distribution and vasomotor effects. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 7 (6), 720-728 (1987).
- Donnerer, J., Stein, C. Evidence for an increase in the release of CGRP from sensory nerves during inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 657, 505-506 (1992).
- Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Release of vasoactive peptides in the extracerebral circulation of humans and the cat during activation of the trigeminovascular system. Annals of Neurology. 23 (2), 193-196 (1988).
- Markowitz, S., Saito, K., Moskowitz, M. A. Neurogenically mediated leakage of plasma protein occurs from blood vessels in dura mater but not brain. The Journal of Neuroscience. 7 (12), 4129-4136 (1987).
- Saito, K., Markowitz, S., Moskowitz, M. A. Ergot alkaloids block neurogenic extravasation in dura mater: proposed action in vascular headaches. Annals of Neurology. 24 (6), 732-737 (1988).
- Lassen, L. H., et al. CGRP may play a causative role in migraine. Cephalalgia. 22 (1), 54-61 (2002).
- Cady, R. K., Vause, C. V., Ho, T. W., Bigal, M. E., Durham, P. L. Elevated saliva calcitonin gene-related peptide levels during acute migraine predict therapeutic response to rizatriptan. Headache. 49 (9), 1258-1266 (2009).
- Cernuda-Morollón, E., et al. Interictal increase of CGRP levels in peripheral blood as a biomarker for chronic migraine. Neurology. 81 (14), 1191-1196 (2013).
- Messlinger, K. The big CGRP flood-sources, sinks and signalling sites in the trigeminovascular system. The Journal of Headache and Pain. 19, 22 (2018).
- Ochoa-Callejero, L., et al. Circulating levels of calcitonin gene-related peptide are lower in COVID-19 patients. Journal of the Endocrine Society. 5 (3), (2021).
- Rizzi, M., et al. CGRP plasma levels correlate with the clinical evolution and prognosis of hospitalized acute COVID-19 patients. Viruses. 14 (10), 2123 (2022).
- Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache. Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).
- Sarchielli, P., et al. Clinical-biochemical correlates of migraine attacks in rizatriptan responders and non-responders. Cephalalgia. 26 (3), 257-265 (2006).
- Greco, R., et al. Plasma levels of CGRP and expression of specific microRNAs in blood cells of episodic and chronic migraine subjects: towards the identification of a panel of peripheral biomarkers of migraine. The Journal of Headache and Pain. 21 (1), 122 (2020).
- Tvedskov, J. F., et al. No increase of calcitonin gene-related peptide in jugular blood during migraine. Annals of Neurology. 58 (4), 561-568 (2005).
- Pellesi, L., et al. Plasma levels of CGRP during a 2-h infusion of VIP in healthy volunteers and patients with migraine: An exploratory study. Frontiers in Neurology. 13, 871176 (2022).
- Kruuse, C., Iversen, H. K., Jansen-Olesen, I., Edvinsson, L., Olesen, J. Calcitonin gene-related peptide (CGRP) levels during glyceryl trinitrate (GTN)-induced headache in healthy volunteers. Cephalalgia. 30 (4), 467-474 (2010).
- Kraenzlin, M. E., Ch’ng, J. L., Mulderry, P. K., Ghatei, M. A., Bloom, S. R. Infusion of a novel peptide, calcitonin gene-related peptide (CGRP) in man. Pharmacokinetics and effects on gastric acid secretion and on gastrointestinal hormones. Regulatory Peptides. 10 (2-3), 189-197 (1985).
- Brain, S. D., Williams, T. J. Substance P regulates the vasodilator activity of calcitonin gene-related peptide. Nature. 335 (6185), 73-75 (1988).
- Kim, Y. -. G., Lone, A. M., Nolte, W. M., Saghatelian, A. Peptidomics approach to elucidate the proteolytic regulation of bioactive peptides. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (22), 8523-8527 (2012).
- Katayama, M., et al. Catabolism of calcitonin gene-related peptide and substance P by neutral endopeptidase. Peptides. 12 (3), 563-567 (1991).
- Hartopo, A. B., et al. Endothelin-converting enzyme-1 gene ablation attenuates pulmonary fibrosis via CGRP-cAMP/EPAC1 pathway. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 48 (4), 465-476 (2013).
- Mair, J., et al. Plasma CGRP in acute myocardial infarction. Lancet. 335 (8682), 168 (1990).
- Antúnez, C., et al. Calcitonin gene-related peptide modulates interleukin-13 in circulating cutaneous lymphocyte-associated antigen-positive T cells in patients with atopic dermatitis. The British Journal of Dermatology. 161 (3), 547-553 (2009).
- Gangula, P. R., et al. Pregnancy and steroid hormones enhance the vasodilation responses to CGRP in rats. The American Journal of Physiology. 276 (1), H284-H288 (1999).
- Hernanz, A., Medina, S., de Miguel, E., Martín-Mola, E. Effect of calcitonin gene-related peptide, neuropeptide Y, substance P, and vasoactive intestinal peptide on interleukin-1beta, interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha production by peripheral whole blood cells from rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients. Regulatory Peptides. 115 (1), 19-24 (2003).
- Takeba, Y., Suzuki, N., Kaneko, A., Asai, T., Sakane, T. Evidence for neural regulation of inflammatory synovial cell functions by secreting calcitonin gene-related peptide and vasoactive intestinal peptide in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism. 42 (11), 2418-2429 (1999).
- Ahmed, M., Srinivasan, G. R., Theodorsson, E., Schultzberg, M., Kreicbergs, A. Effects of surgical denervation on substance P and calcitonin gene-related peptide in adjuvant arthritis. Peptides. 16 (4), 569-579 (1995).
- Neugebauer, V., Rümenapp, P., Schaible, H. G. Calcitonin gene-related peptide is involved in the spinal processing of mechanosensory input from the rat’s knee joint and in the generation and maintenance of hyperexcitability of dorsal horn-neurons during development of acute inflammation. Neuroscience. 71 (4), 1095-1109 (1996).
- Wang, L. H., et al. Serum levels of calcitonin gene-related peptide and substance P are decreased in patients with diabetes mellitus and coronary artery disease. The Journal of International Medical Research. 40 (1), 134-140 (2012).
- Zelissen, P. M., Koppeschaar, H. P., Lips, C. J., Hackeng, W. H. Calcitonin gene-related peptide in human obesity. Peptides. 12 (4), 861-863 (1991).
- World Health Organization. WHO Guidelines on Drawing Blood: Best Practices in Phlebotomy. 3, Blood-sampling systems. World Health Organization. , (2010).
- Raffaelli, B., et al. Plasma calcitonin gene-related peptide (CGRP) in migraine and endometriosis during the menstrual cycle. Annals of Clinical and Translational Neurology. 8 (6), 1251-1259 (2021).
- Andreasson, U., et al. A practical guide to immunoassay method validation. Frontiers in Neurology. 6, 179 (2015).
- Messlinger, K., et al. CGRP measurements in human plasma-a methodological study. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 41 (13), 1359-1373 (2021).
- Sakamoto, S., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. Journal of Natural Medicines. 72 (1), 32-42 (2018).
- Lee, J. -. E., Kim, S. Y., Shin, S. -. Y. Effect of repeated freezing and thawing on biomarker stability in plasma and serum samples. Osong Public Health and Research Perspectives. 6 (6), 357-362 (2015).
- Fan, P. -. C., Kuo, P. -. H., Lee, M. T., Chang, S. -. H., Chiou, L. -. C. Plasma calcitonin gene-related peptide: A potential biomarker for diagnosis and therapeutic responses in pediatric migraine. Frontiers in Neurology. 10, 10 (2019).
- Raffaelli, B., et al. Change of CGRP plasma concentrations in migraine after discontinuation of CGRP-(receptor) monoclonal antibodies. Pharmaceutics. 15 (1), 293 (2023).
