Summary

Detecção e quantificação de peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) em plasma humano usando um ensaio imunoenzimático modificado

Published: June 16, 2023
doi:

Summary

Os dados publicados relativos às concentrações de peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) no plasma humano são inconsistentes. Essas inconsistências podem ser devidas à falta de uma metodologia padronizada e validada para quantificar esse neuropeptídeo. Aqui, descrevemos um protocolo validado de ensaio imunoenzimático (ELISA) para purificar e quantificar CGRP em plasma humano.

Abstract

O peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) é um neuropeptídeo vasoativo que desempenha um papel putativo na fisiopatologia das enxaquecas e pode ser um candidato ao status de biomarcador. A CGRP é liberada das fibras neuronais após a ativação e induz inflamação neurogênica estéril e vasodilatação arterial na vasculatura que recebe inervação eferente do trigêmeo. A presença de CGRP na vasculatura periférica tem estimulado investigações para detectar e quantificar esse neuropeptídeo no plasma humano usando ensaios proteômicos, como o ensaio imunoenzimático (ELISA). No entanto, sua meia-vida de 6,9 min e a variabilidade nos detalhes técnicos dos protocolos de ensaio, que muitas vezes não são totalmente descritos, têm gerado dados inconsistentes de ELISA CGRP na literatura. Aqui, um protocolo ELISA modificado para purificação e quantificação de CGRP em plasma humano é apresentado. As etapas processuais envolvem coleta e preparação da amostra, extração usando um sorvente polar como meio de purificação, etapas adicionais para bloquear a ligação não específica e quantificação via ELISA. Além disso, o protocolo foi validado com experimentos de spike e recuperação e linearidade de diluição. Este protocolo validado pode, teoricamente, ser usado para quantificar as concentrações de CGRP no plasma de indivíduos não apenas com enxaqueca, mas também com outras doenças nas quais a CGRP pode desempenhar um papel.

Introduction

O peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) é um neuropeptídeo de 37 aminoácidos que está presente em fibras neuronais com localização perivascular, bem como em tecidos não neuronais. As duas formas de CGRP, α- e β-CGRP, compartilham mais de 90% de homologia e compartilham funções fisiológicas; entretanto, o αCGRP é encontrado no sistema nervoso central e periférico, enquanto o βCGRP é encontrado no sistema nervoso entérico 1,2. Após a ativação do nociceptor e exocitose cálcio-dependente, a CGRP é liberada dos neurônios, induzindo inflamação neurogênica estéril envolvendo vasodilatação arterial e extravasamento de proteínas plasmáticas 3,4,5,6,7. A partir daí, a CGRP surge nos vasos pós-capilares e pode ser um biomarcador para doenças que causam ativação nociceptiva aferente, como a migrânea8,9,10,11. De notar, CGRP igualmente tem sido implicado em COVID-19 através de seu papel na angiogénese e modulação imune, e pode prever a evolução desfavorável da doença12,13. Assim, um protocolo para a quantificação precisa de CGRP em plasma humano poderia ter um valor amplo.

A maior atenção talvez tenha sido dada ao papel da CGRP na enxaqueca. Com base em estudos pré-clínicos e clínicos, a CGRP tem sido apontada como um possível biomarcador para enxaqueca e como alvo de tratamento 3,4,5,6,7,8,9,10. Alguns estudos encontraram elevação da CGRP em coortes com migrânea episódica em relação aos participantes controles10,14,15. O sucesso dos inibidores de CGRP em ensaios clínicos para o tratamento da enxaqueca parece implicar CGRP elevado como um fator causal para enxaqueca. Entretanto, nem todos os pesquisadores corroboraram esses resultados16,17,18,19. Além disso, o papel da CGRP nos sintomas não cefálicos da enxaqueca ainda não foi elucidado; o presente trabalho foi motivado pelo desejo de compreender o papel da CGRP nos sintomas vestibulares da migrânea.

Dados inconsistentes de imunoensaio de CGRP na literatura podem ser devidos a várias razões. Em primeiro lugar, a meia-vida da CGRP na vasculatura periférica é de 6,9 min 20, devido à atividade de serinoproteases 21, enzimas degradadoras de insulina e outras metaloproteases 22, endopeptidases neutras 23 e enzima conversora de endotelina-1 24. Em segundo lugar, os detalhes técnicos variáveis dos imunoensaios usados para quantificar a CGRP não são totalmente descritos nesses estudos. Por fim, a falta de padronização da metodologia de imunoensaio complica ainda mais o quadro.

Este artigo descreve um protocolo de ensaio imunoenzimático modificado (ELISA) que permite a purificação e quantificação precisa de α- e βCGRP em plasma humano. Os anticorpos do kit não são reativos cruzados com amilina, calcitonina ou substância P. Esse protocolo passou pelos experimentos de validação necessários, como spike e recuperação e linearidade de diluição, cujos dados são aqui apresentados. Este protocolo de ELISA CGRP que passou por validação não foi descrito anteriormente na literatura. Esse protocolo pode ser utilizado para quantificar a CGRP no plasma humano no contexto da migrânea, bem como das doenças cardiológicas2,25, dermatológicas26, obstétricas27, reumatológicas28,29, musculoesqueléticas30,31, endócrinas32,33 e virais12,13, nas quais a CGRP tem sido implicada.

Protocol

Este protocolo foi desenvolvido utilizando amostras de plasma humano de indivíduos consentidos, com aprovação do Johns Hopkins Institutional Review Board (NA_00092491). 1. Coleta e preparo das amostras Coletar 5 mL de sangue total da veia antecubital por métodos padrão de punção venosa34 em um tubo de coleta de 6 mL de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) vacutainer. Adicionar 0,5 mL de inibidor competitivo de ser…

Representative Results

Existem várias etapas importantes no protocolo que devem ser destacadas. Em primeiro lugar, a aprotinina, um inibidor da serina protease, deve ser adicionada às amostras de sangue total imediatamente após a coleta para evitar maior degradação enzimática da CGRP. Demonstrou-se que as serinoproteases desempenham um papel no metabolismo do CGRP, e um estudo anterior também utilizou a aprotinina na quantificação do CGRP em humanos21,35. Se inibidores de prot…

Discussion

Este artigo descreve um protocolo validado que permite a detecção e quantificação de CGRP em plasma humano. Este protocolo foi sintetizado depois que kits comerciais de ELISA CGRP não quantificaram com precisão esta molécula. Após o estabelecimento de um protocolo de preparo da amostra e de uma curva padrão válida, os experimentos de spike e recuperação e linearidade da diluição mostraram que a porcentagem de recuperações foi muito menor do que o esperado. Resultados semelhantes foram encontrados com outr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer a Robert N. Cole, Lauren R. DeVine e Marcos Iglesias por suas discussões úteis sobre este protocolo. Isso foi apoiado em parte pelo financiamento da American Otological Society (Fellowship Grant, PSK), da American Hearing Research Foundation (90066548/90072266, JPC) e do National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS), um componente dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) e do NIH Roadmap for Medical Research (UL1 TR003098, NSF). O conteúdo da publicação é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente a visão oficial do Johns Hopkins ICTR, NCATS ou NIH.

Materials

1.7 mL Safeseal microcentrifuge tube Sorenson Bioscience, Inc. 11510
99% methanol ThermoFisher Scientific L13255.0F
15 mL conical centrifuge tube Falcon 14-959-49B
2 mL round bottom sterile cryovials CRYO.S 122263
4% acetic acid ThermoFisher Scientific 035572.K2
6.0 mL Vacutainer EDTA collection tube BD 367863
Allegra 64R benchtop centrifuge Beckman Coulter, Inc. 367586
Aprotinin VWR 76344-814
CGRP (human) ELISA kit Bertin Bioreagent A05481
CGRP stock Bertin Bioreagent
EIA Buffer Bertin Bioreagent A07000
Ellman's Reagent Bertin Bioreagent A09000_49+1
Multichannel pipettes ThermoFisher Scientific 4661180N
Oasis HLB 3 cc Vac Cartridges Waters WAT094226
Orbital Shaker Bellco 7744-01010
Precision micropipettes ThermoFisher Scientific F144055MG
SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate reader Molecular Devices Part Number M2
TBS/Fish Gelatin Bioworld, from Fischer Scientific 50-199-167
Ultrapure water ELISA Grade Bertin Bioreagent A07001
Vacufuge plus – Centrifuge Concentrator Eppendorf 22820109
Wash Buffer Bertin Bioreagent A17000

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Krishnan, P. S., Zamuner, F. T., Jenks, C. M., Xie, J. Y., Zhang, L., Lehar, M., Fedarko, N. S., Brait, M., Carey, J. P. Detection and Quantification of Calcitonin Gene-Related Peptide (CGRP) in Human Plasma Using a Modified Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. J. Vis. Exp. (196), e64775, doi:10.3791/64775 (2023).

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