Detecção e quantificação de peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) em plasma humano usando um ensaio imunoenzimático modificado

O peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) é um neuropeptídeo de 37 aminoácidos que está presente em fibras neuronais com localização perivascular, bem como em tecidos não neuronais. As duas formas de CGRP, α- e β-CGRP, compartilham mais de 90% de homologia e compartilham funções fisiológicas; entretanto, o αCGRP é encontrado no sistema nervoso central e periférico, enquanto o βCGRP é encontrado no sistema nervoso entérico ^1,2. Após a ativação do nociceptor e exocitose cálcio-dependente, a CGRP é liberada dos neurônios, induzindo inflamação neurogênica estéril envolvendo vasodilatação arterial e extravasamento de proteínas plasmáticas 3,4,5,6,7. A partir daí, a CGRP surge nos vasos pós-capilares e pode ser um biomarcador para doenças que causam ativação nociceptiva aferente, como a migrânea8,9,10,11. De notar, CGRP igualmente tem sido implicado em COVID-19 através de seu papel na angiogénese e modulação imune, e pode prever a evolução desfavorável da doença^12,13. Assim, um protocolo para a quantificação precisa de CGRP em plasma humano poderia ter um valor amplo.

A maior atenção talvez tenha sido dada ao papel da CGRP na enxaqueca. Com base em estudos pré-clínicos e clínicos, a CGRP tem sido apontada como um possível biomarcador para enxaqueca e como alvo de tratamento 3,4,5,6,7,8,9,10. Alguns estudos encontraram elevação da CGRP em coortes com migrânea episódica em relação aos participantes controles^10,14,15. O sucesso dos inibidores de CGRP em ensaios clínicos para o tratamento da enxaqueca parece implicar CGRP elevado como um fator causal para enxaqueca. Entretanto, nem todos os pesquisadores corroboraram esses resultados^16,17,18,19. Além disso, o papel da CGRP nos sintomas não cefálicos da enxaqueca ainda não foi elucidado; o presente trabalho foi motivado pelo desejo de compreender o papel da CGRP nos sintomas vestibulares da migrânea.

Dados inconsistentes de imunoensaio de CGRP na literatura podem ser devidos a várias razões. Em primeiro lugar, a meia-vida da CGRP na vasculatura periférica é de 6,9 min 20, devido à atividade de serinoproteases 21, enzimas degradadoras de insulina e outras metaloproteases 22, endopeptidases neutras 23 e enzima conversora de endotelina-1 ²⁴. Em segundo lugar, os detalhes técnicos variáveis dos imunoensaios usados para quantificar a CGRP não são totalmente descritos nesses estudos. Por fim, a falta de padronização da metodologia de imunoensaio complica ainda mais o quadro.

Este artigo descreve um protocolo de ensaio imunoenzimático modificado (ELISA) que permite a purificação e quantificação precisa de α- e βCGRP em plasma humano. Os anticorpos do kit não são reativos cruzados com amilina, calcitonina ou substância P. Esse protocolo passou pelos experimentos de validação necessários, como spike e recuperação e linearidade de diluição, cujos dados são aqui apresentados. Este protocolo de ELISA CGRP que passou por validação não foi descrito anteriormente na literatura. Esse protocolo pode ser utilizado para quantificar a CGRP no plasma humano no contexto da migrânea, bem como das doenças cardiológicas2,25, dermatológicas26, obstétricas27, reumatológicas28,29, musculoesqueléticas30,31, endócrinas32,33 e virais12,13, nas quais a CGRP tem sido implicada.