Summary

Rilevazione e quantificazione del peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP) nel plasma umano mediante un saggio di immunoassorbimento enzimatico modificato

Published: June 16, 2023
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Summary

I dati pubblicati relativi alle concentrazioni di peptidi correlati al gene della calcitonina (CGRP) nel plasma umano sono incoerenti. Queste incongruenze possono essere dovute alla mancanza di una metodologia standardizzata e convalidata per quantificare questo neuropeptide. Qui, descriviamo un protocollo ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) convalidato per purificare e quantificare CGRP nel plasma umano.

Abstract

Il peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP) è un neuropeptide vasoattivo che svolge un ruolo putativo nella fisiopatologia dell’emicrania e può essere un candidato per lo status di biomarcatore. CGRP viene rilasciato dalle fibre neuronali al momento dell’attivazione e induce infiammazione neurogena sterile e vasodilatazione arteriosa nel sistema vascolare che riceve l’innervazione efferente del trigemino. La presenza di CGRP nel sistema vascolaristico periferico ha stimolato indagini per rilevare e quantificare questo neuropeptide nel plasma umano utilizzando saggi proteomici, come il saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). Tuttavia, la sua emivita di 6,9 minuti e la variabilità nei dettagli tecnici dei protocolli di analisi, che spesso non sono completamente descritti, hanno prodotto dati ELISA CGRP incoerenti in letteratura. Qui viene presentato un protocollo ELISA modificato per la purificazione e la quantificazione del CGRP nel plasma umano. Le fasi procedurali comprendono la raccolta e la preparazione del campione, l’estrazione utilizzando un assorbente polare come mezzo di purificazione, ulteriori fasi per bloccare il legame non specifico e la quantificazione tramite ELISA. Inoltre, il protocollo è stato validato con spike e recupero e linearità degli esperimenti di diluizione. Questo protocollo validato può teoricamente essere utilizzato per quantificare le concentrazioni di CGRP nel plasma di individui non solo con emicrania, ma anche con altre malattie in cui CGRP può svolgere un ruolo.

Introduction

Il peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP) è un neuropeptide di 37 aminoacidi presente nelle fibre neuronali con localizzazione perivascolare e nei tessuti non neuronali. Le due forme di CGRP, α- e β-CGRP, condividono più del 90% di omologia e condividono funzioni fisiologiche; tuttavia, αCGRP si trova nel sistema nervoso centrale e periferico, mentre βCGRP si trova nel sistema nervoso enterico 1,2. Dopo l’attivazione dei nocicettori e l’esocitosi calcio-dipendente, CGRP viene rilasciato dai neuroni, inducendo un’infiammazione neurogena sterile che coinvolge vasodilatazione arteriosa e stravaso di proteine plasmatiche 3,4,5,6,7. Da qui, CGRP appare nei vasi postcapillari e può essere un biomarcatore per le malattie che causano l’attivazione nocicettiva afferente, come l’emicrania 8,9,10,11. Da notare che la CGRP è stata anche implicata nel COVID-19 attraverso il suo ruolo nell’angiogenesi e nella modulazione immunitaria e può prevedere un’evoluzione sfavorevole della malattia12,13. Pertanto, un protocollo per la quantificazione accurata del CGRP nel plasma umano potrebbe avere un valore ampio.

La maggiore attenzione è stata forse data al ruolo di CGRP nell’emicrania. Sulla base di studi preclinici e clinici, CGRP è stato proposto come un possibile biomarcatore per l’emicrania e come bersaglio per il trattamento 3,4,5,6,7,8,9,10. Alcuni studi hanno trovato un aumento di CGRP in coorti con emicrania episodica rispetto ai partecipanti di controllo10,14,15. Il successo degli inibitori CGRP negli studi clinici per il trattamento dell’emicrania sembra implicare un elevato CGRP come fattore causale per l’emicrania. Tuttavia, non tutti gli investigatori hanno confermato questi risultati16,17,18,19. Inoltre, il ruolo di CGRP nei sintomi non cefalei dell’emicrania deve ancora essere chiarito; il lavoro attuale è stato motivato dal desiderio di comprendere il ruolo del CGRP nei sintomi vestibolari dell’emicrania.

Dati immunologici CGRP incoerenti in letteratura potrebbero essere dovuti a diversi motivi. In primo luogo, l’emivita di CGRP nel sistema vascolare periferico è di 6,9 min20, a causa dell’attività delle proteasi serina 21, degli enzimi che degradano l’insulina e di altre metalloproteasi 22, delle endopeptidasi neutre 23 e dell’enzima di conversione dell’endotelina-1 24. In secondo luogo, i dettagli tecnici variabili dei saggi immunologici utilizzati per quantificare CGRP non sono completamente descritti in tali studi. Infine, la mancanza di standardizzazione della metodologia di dosaggio immunologico complica ulteriormente il quadro.

Questo articolo descrive un protocollo ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) modificato che consente la purificazione e la quantificazione accurata di α e βCGRP nel plasma umano. Gli anticorpi del kit non sono cross-reattivi con amilina, calcitonina o sostanza P. Questo protocollo è stato sottoposto agli esperimenti di validazione necessari, come spike e recupero e linearità di diluizione, i cui dati sono presentati qui. Tale protocollo ELISA CGRP sottoposto a validazione non è stato precedentemente completamente descritto in letteratura. Questo protocollo può essere utilizzato per quantificare CGRP nel plasma umano nel contesto dell’emicrania e cardiologica2,25, dermatologica 26, ostetrica 27, reumatologica28,29, muscoloscheletrica 30,31, endocrina 32,33 e malattie virali 12,13 in cui CGRP è stato implicato.

Protocol

Questo protocollo è stato sviluppato utilizzando campioni di plasma umano da individui consenzienti con l’approvazione del Johns Hopkins Institutional Review Board (NA_00092491). 1. Raccolta e preparazione dei campioni Raccogliere 5 ml di sangue intero dalla vena antecubitale con metodi di venipuntura standard34 in una provetta di raccolta dell’acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) vacutainer da 6 ml. Aggiungere 0,5 mL di…

Representative Results

Ci sono diversi passaggi chiave nel protocollo che dovrebbero essere evidenziati. In primo luogo, l’aprotinina, un inibitore della proteasi serina, deve essere aggiunta ai campioni di sangue intero immediatamente dopo la raccolta per prevenire un’ulteriore degradazione enzimatica di CGRP. Le proteasi serina hanno dimostrato di svolgere un ruolo nel metabolismo della CGRP e uno studio precedente ha anche utilizzato l’aprotinina per quantificare la CGRP nell’uomo21,35</s…

Discussion

Questo articolo descrive un protocollo convalidato che consente la rilevazione e la quantificazione di CGRP nel plasma umano. Questo protocollo è stato sintetizzato dopo che i kit commerciali CGRP ELISA sono stati trovati per non quantificare accuratamente questa molecola. Dopo aver stabilito un protocollo di preparazione del campione e una curva standard valida, gli esperimenti di spike e recupero e linearità della diluizione hanno mostrato che la percentuale di recuperi era molto più bassa del previsto. Risultati si…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare Robert N. Cole, Lauren R. DeVine e Marcos Iglesias per le loro utili discussioni su questo protocollo. Ciò è stato sostenuto in parte dai finanziamenti dell’American Otological Society (Fellowship Grant, PSK), dell’American Hearing Research Foundation (90066548 / 90072266, JPC) e del National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS), un componente del National Institutes of Health (NIH) e NIH Roadmap for Medical Research (UL1 TR003098, NSF). I contenuti della pubblicazione sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale della Johns Hopkins ICTR, NCATS, o NIH.

Materials

1.7 mL Safeseal microcentrifuge tube Sorenson Bioscience, Inc. 11510
99% methanol ThermoFisher Scientific L13255.0F
15 mL conical centrifuge tube Falcon 14-959-49B
2 mL round bottom sterile cryovials CRYO.S 122263
4% acetic acid ThermoFisher Scientific 035572.K2
6.0 mL Vacutainer EDTA collection tube BD 367863
Allegra 64R benchtop centrifuge Beckman Coulter, Inc. 367586
Aprotinin VWR 76344-814
CGRP (human) ELISA kit Bertin Bioreagent A05481
CGRP stock Bertin Bioreagent
EIA Buffer Bertin Bioreagent A07000
Ellman's Reagent Bertin Bioreagent A09000_49+1
Multichannel pipettes ThermoFisher Scientific 4661180N
Oasis HLB 3 cc Vac Cartridges Waters WAT094226
Orbital Shaker Bellco 7744-01010
Precision micropipettes ThermoFisher Scientific F144055MG
SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate reader Molecular Devices Part Number M2
TBS/Fish Gelatin Bioworld, from Fischer Scientific 50-199-167
Ultrapure water ELISA Grade Bertin Bioreagent A07001
Vacufuge plus – Centrifuge Concentrator Eppendorf 22820109
Wash Buffer Bertin Bioreagent A17000

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Krishnan, P. S., Zamuner, F. T., Jenks, C. M., Xie, J. Y., Zhang, L., Lehar, M., Fedarko, N. S., Brait, M., Carey, J. P. Detection and Quantification of Calcitonin Gene-Related Peptide (CGRP) in Human Plasma Using a Modified Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. J. Vis. Exp. (196), e64775, doi:10.3791/64775 (2023).

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