זיהוי וכימות של פפטיד הקשור לגן קלציטונין (CGRP) בפלזמה אנושית באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים שונה
Summary
נתונים שפורסמו בנוגע לריכוזי פפטיד הקשור לגן קלציטונין (CGRP) בפלזמה אנושית אינם עקביים. חוסר עקביות זה עשוי לנבוע מהיעדר מתודולוגיה מתוקננת ומתוקפת לכימות נוירופפטיד זה. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול מאומת של בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזימים (ELISA) לטיהור וכימות CGRP בפלזמה אנושית.
Abstract
פפטיד הקשור לגן קלציטונין (CGRP) הוא נוירופפטיד וזואקטיבי הממלא תפקיד משוער בפתופיזיולוגיה של מיגרנות, ועשוי להיות מועמד למצב של סמן ביולוגי. CGRP משתחרר מסיבים עצביים עם הפעלתו וגורם לדלקת נוירוגנית סטרילית ולהרחבת כלי דם עורקיים בכלי הדם המקבלים עצבוב טריגמינלי תוסס. נוכחותו של CGRP בכלי הדם ההיקפיים דרבנה חקירות לזהות ולכמת נוירופפטיד זה בפלזמה אנושית באמצעות בדיקות פרוטאומיות, כגון בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA). עם זאת, זמן מחצית החיים של 6.9 דקות והשונות בפרטים הטכניים של פרוטוקולי הבדיקה, שלעתים קרובות אינם מתוארים במלואם, הניבו נתוני CGRP ELISA לא עקביים בספרות. כאן מוצג פרוטוקול ELISA שונה לטיהור וכימות CGRP בפלזמה אנושית. השלבים הפרוצדורליים כוללים איסוף והכנת דגימות, חילוץ באמצעות סורבנט קוטבי כאמצעי לטיהור, צעדים נוספים לחסימת קשירה לא ספציפית, וכימות באמצעות ELISA. יתר על כן, הפרוטוקול אומת עם ספייק והתאוששות ולינאריות של ניסויי דילול. פרוטוקול מאומת זה יכול לשמש באופן תיאורטי לכימות ריכוזי CGRP בפלזמה של אנשים לא רק עם מיגרנה, אלא גם עם מחלות אחרות שבהן CGRP עשוי לשחק תפקיד.
Introduction
פפטיד הקשור לגן קלציטונין (CGRP) הוא נוירופפטיד של 37 חומצות אמינו שנמצא בסיבים עצביים עם לוקליזציה פריווסקולרית, כמו גם ברקמות שאינן עצביות. שתי הצורות של CGRP, α ו-β-CGRP, חולקות יותר מ-90% הומולוגיה וחולקות תפקודים פיזיולוגיים; עם זאת, αCGRP נמצא במערכת העצבים המרכזית וההיקפית, בעוד βCGRP נמצא במערכת העצבים האנטרית 1,2. עם הפעלת nociceptor ואקסוציטוזה תלוית סידן, CGRP משתחרר מנוירונים, וגורם לדלקת נוירוגנית סטרילית המערבת הרחבת כלי דם עורקיים ואקסטרווזיה של חלבון פלזמה 3,4,5,6,7. מכאן, CGRP מופיע בכלי הדם שלאחר הנימים ועשוי להיות סמן ביולוגי למחלות הגורמות להפעלה נוסיספטיבית afferent, כגון מיגרנה 8,9,10,11. יש לציין כי CGRP היה מעורב גם ב- COVID-19 באמצעות תפקידו באנגיוגנזה ובאפנון חיסוני, ועשוי לחזות אבולוציה שלילית של מחלות12,13. לפיכך, פרוטוקול לכימות מדויק של CGRP בפלזמה אנושית יכול להיות בעל ערך רחב.
תשומת הלב הרבה ביותר הוקדשה אולי לתפקיד של CGRP במיגרנה. בהתבסס על מחקרים פרה-קליניים וקליניים, CGRP הוצג כסמן ביולוגי אפשרי למיגרנה וכיעד לטיפול 3,4,5,6,7,8,9,10. מחקרים מסוימים מצאו עלייה של CGRP בקבוצות עם מיגרנה אפיזודית ביחס למשתתפי הביקורת10,14,15. נראה כי ההצלחה של מעכבי CGRP בניסויים קליניים לטיפול במיגרנה מרמזת על CGRP מוגבר כגורם סיבתי למיגרנות. עם זאת, לא כל החוקרים אישרו תוצאות אלה16,17,18,19. יתר על כן, תפקידו של CGRP בסימפטומים שאינם כאבי ראש של מיגרנה טרם הובהר; העבודה הנוכחית הונעה על ידי הרצון להבין את התפקיד של CGRP בסימפטומים שיווי המשקל של מיגרנה.
נתוני בדיקת CGRP לא עקביים בספרות יכולים לנבוע מכמה סיבות. ראשית, זמן מחצית החיים של CGRP בכלי הדם ההיקפיים הוא 6.9 דקות 20, בשל הפעילות של פרוטאזות סרין 21, אנזימים מפרקים אינסולין ומטלופרוטאזות אחרות 22, אנדופפטידאזות ניטרליות 23, ואנזים ממיר אנדותלין-1 24. שנית, הפרטים הטכניים המשתנים של הבדיקות החיסוניות המשמשות לכימות CGRP אינם מתוארים במלואם במחקרים כאלה. לבסוף, חוסר הסטנדרטיזציה של מתודולוגיית החיסון מסבך את התמונה עוד יותר.
מאמר זה מתאר פרוטוקול שונה של בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA) המאפשר טיהור וכימות מדויק של α ו- βCGRP בפלזמה אנושית. הנוגדנים של הערכה אינם צולבים עם עמילין, קלציטונין או חומר P. פרוטוקול זה עבר את ניסויי התיקוף הנדרשים, כגון ספייק ושחזור ולינאריות של דילול, שהנתונים עבורם מוצגים כאן. פרוטוקול CGRP ELISA כזה שעבר אימות לא תואר בעבר במלואו בספרות. פרוטוקול זה יכול לשמש לכימות CGRP בפלזמה אנושית בהקשר של מיגרנה, כמו גם קרדיולוגית2,25, דרמטולוגית 26, מיילדותית 27, ראומטולוגית28,29, שרירים ושלד 30,31, אנדוקרינית 32,33, ומחלות ויראליות12,13 שבהן CGRP היה מעורב.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מתאר פרוטוקול מאומת המאפשר זיהוי וכימות של CGRP בפלזמה אנושית. פרוטוקול זה סונתז לאחר שנמצא כי ערכות CGRP ELISA מסחריות אינן מכמתות במדויק מולקולה זו. לאחר קביעת פרוטוקול הכנת דגימה ועקומה סטנדרטית תקפה, ספייק והתאוששות ולינאריות של ניסויי דילול הראו כי אחוז המחלימים היה נמוך בהרבה מהצפ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לרוברט נ’ קול, לורן ר’ דוויין ומרקוס איגלסיאס על הדיונים המועילים שלהם בנוגע לפרוטוקול זה. זה נתמך בחלקו על ידי מימון מהאגודה האמריקאית לאף אוטולוגיה (מענק מלגה, PSK), הקרן האמריקאית לחקר השמיעה (90066548/90072266, JPC), והמרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום (NCATS), מרכיב של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH), ומפת הדרכים של NIH למחקר רפואי (UL1 TR003098, NSF). תוכן הפרסום הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את ההשקפה הרשמית של ICTR ג’ונס הופקינס, NCATS או NIH.
Materials
| 1.7 mL Safeseal microcentrifuge tube | Sorenson Bioscience, Inc. | 11510 | |
| 99% methanol | ThermoFisher Scientific | L13255.0F | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 14-959-49B | |
| 2 mL round bottom sterile cryovials | CRYO.S | 122263 | |
| 4% acetic acid | ThermoFisher Scientific | 035572.K2 | |
| 6.0 mL Vacutainer EDTA collection tube | BD | 367863 | |
| Allegra 64R benchtop centrifuge | Beckman Coulter, Inc. | 367586 | |
| Aprotinin | VWR | 76344-814 | |
| CGRP (human) ELISA kit | Bertin Bioreagent | A05481 | |
| CGRP stock | Bertin Bioreagent | ||
| EIA Buffer | Bertin Bioreagent | A07000 | |
| Ellman's Reagent | Bertin Bioreagent | A09000_49+1 | |
| Multichannel pipettes | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
| Oasis HLB 3 cc Vac Cartridges | Waters | WAT094226 | |
| Orbital Shaker | Bellco | 7744-01010 | |
| Precision micropipettes | ThermoFisher Scientific | F144055MG | |
| SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate reader | Molecular Devices | Part Number M2 | |
| TBS/Fish Gelatin | Bioworld, from Fischer Scientific | 50-199-167 | |
| Ultrapure water ELISA Grade | Bertin Bioreagent | A07001 | |
| Vacufuge plus – Centrifuge Concentrator | Eppendorf | 22820109 | |
| Wash Buffer | Bertin Bioreagent | A17000 |
References
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. -. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Brain, S. D., Grant, A. D. Vascular actions of calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin. Physiological Reviews. 84 (3), 903-934 (2004).
- Edvinsson, L., Ekman, R., Jansen, I., McCulloch, J., Uddman, R. Calcitonin gene-related peptide and cerebral blood vessels: distribution and vasomotor effects. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 7 (6), 720-728 (1987).
- Donnerer, J., Stein, C. Evidence for an increase in the release of CGRP from sensory nerves during inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 657, 505-506 (1992).
- Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Release of vasoactive peptides in the extracerebral circulation of humans and the cat during activation of the trigeminovascular system. Annals of Neurology. 23 (2), 193-196 (1988).
- Markowitz, S., Saito, K., Moskowitz, M. A. Neurogenically mediated leakage of plasma protein occurs from blood vessels in dura mater but not brain. The Journal of Neuroscience. 7 (12), 4129-4136 (1987).
- Saito, K., Markowitz, S., Moskowitz, M. A. Ergot alkaloids block neurogenic extravasation in dura mater: proposed action in vascular headaches. Annals of Neurology. 24 (6), 732-737 (1988).
- Lassen, L. H., et al. CGRP may play a causative role in migraine. Cephalalgia. 22 (1), 54-61 (2002).
- Cady, R. K., Vause, C. V., Ho, T. W., Bigal, M. E., Durham, P. L. Elevated saliva calcitonin gene-related peptide levels during acute migraine predict therapeutic response to rizatriptan. Headache. 49 (9), 1258-1266 (2009).
- Cernuda-Morollón, E., et al. Interictal increase of CGRP levels in peripheral blood as a biomarker for chronic migraine. Neurology. 81 (14), 1191-1196 (2013).
- Messlinger, K. The big CGRP flood-sources, sinks and signalling sites in the trigeminovascular system. The Journal of Headache and Pain. 19, 22 (2018).
- Ochoa-Callejero, L., et al. Circulating levels of calcitonin gene-related peptide are lower in COVID-19 patients. Journal of the Endocrine Society. 5 (3), (2021).
- Rizzi, M., et al. CGRP plasma levels correlate with the clinical evolution and prognosis of hospitalized acute COVID-19 patients. Viruses. 14 (10), 2123 (2022).
- Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache. Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).
- Sarchielli, P., et al. Clinical-biochemical correlates of migraine attacks in rizatriptan responders and non-responders. Cephalalgia. 26 (3), 257-265 (2006).
- Greco, R., et al. Plasma levels of CGRP and expression of specific microRNAs in blood cells of episodic and chronic migraine subjects: towards the identification of a panel of peripheral biomarkers of migraine. The Journal of Headache and Pain. 21 (1), 122 (2020).
- Tvedskov, J. F., et al. No increase of calcitonin gene-related peptide in jugular blood during migraine. Annals of Neurology. 58 (4), 561-568 (2005).
- Pellesi, L., et al. Plasma levels of CGRP during a 2-h infusion of VIP in healthy volunteers and patients with migraine: An exploratory study. Frontiers in Neurology. 13, 871176 (2022).
- Kruuse, C., Iversen, H. K., Jansen-Olesen, I., Edvinsson, L., Olesen, J. Calcitonin gene-related peptide (CGRP) levels during glyceryl trinitrate (GTN)-induced headache in healthy volunteers. Cephalalgia. 30 (4), 467-474 (2010).
- Kraenzlin, M. E., Ch’ng, J. L., Mulderry, P. K., Ghatei, M. A., Bloom, S. R. Infusion of a novel peptide, calcitonin gene-related peptide (CGRP) in man. Pharmacokinetics and effects on gastric acid secretion and on gastrointestinal hormones. Regulatory Peptides. 10 (2-3), 189-197 (1985).
- Brain, S. D., Williams, T. J. Substance P regulates the vasodilator activity of calcitonin gene-related peptide. Nature. 335 (6185), 73-75 (1988).
- Kim, Y. -. G., Lone, A. M., Nolte, W. M., Saghatelian, A. Peptidomics approach to elucidate the proteolytic regulation of bioactive peptides. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (22), 8523-8527 (2012).
- Katayama, M., et al. Catabolism of calcitonin gene-related peptide and substance P by neutral endopeptidase. Peptides. 12 (3), 563-567 (1991).
- Hartopo, A. B., et al. Endothelin-converting enzyme-1 gene ablation attenuates pulmonary fibrosis via CGRP-cAMP/EPAC1 pathway. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 48 (4), 465-476 (2013).
- Mair, J., et al. Plasma CGRP in acute myocardial infarction. Lancet. 335 (8682), 168 (1990).
- Antúnez, C., et al. Calcitonin gene-related peptide modulates interleukin-13 in circulating cutaneous lymphocyte-associated antigen-positive T cells in patients with atopic dermatitis. The British Journal of Dermatology. 161 (3), 547-553 (2009).
- Gangula, P. R., et al. Pregnancy and steroid hormones enhance the vasodilation responses to CGRP in rats. The American Journal of Physiology. 276 (1), H284-H288 (1999).
- Hernanz, A., Medina, S., de Miguel, E., Martín-Mola, E. Effect of calcitonin gene-related peptide, neuropeptide Y, substance P, and vasoactive intestinal peptide on interleukin-1beta, interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha production by peripheral whole blood cells from rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients. Regulatory Peptides. 115 (1), 19-24 (2003).
- Takeba, Y., Suzuki, N., Kaneko, A., Asai, T., Sakane, T. Evidence for neural regulation of inflammatory synovial cell functions by secreting calcitonin gene-related peptide and vasoactive intestinal peptide in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism. 42 (11), 2418-2429 (1999).
- Ahmed, M., Srinivasan, G. R., Theodorsson, E., Schultzberg, M., Kreicbergs, A. Effects of surgical denervation on substance P and calcitonin gene-related peptide in adjuvant arthritis. Peptides. 16 (4), 569-579 (1995).
- Neugebauer, V., Rümenapp, P., Schaible, H. G. Calcitonin gene-related peptide is involved in the spinal processing of mechanosensory input from the rat’s knee joint and in the generation and maintenance of hyperexcitability of dorsal horn-neurons during development of acute inflammation. Neuroscience. 71 (4), 1095-1109 (1996).
- Wang, L. H., et al. Serum levels of calcitonin gene-related peptide and substance P are decreased in patients with diabetes mellitus and coronary artery disease. The Journal of International Medical Research. 40 (1), 134-140 (2012).
- Zelissen, P. M., Koppeschaar, H. P., Lips, C. J., Hackeng, W. H. Calcitonin gene-related peptide in human obesity. Peptides. 12 (4), 861-863 (1991).
- World Health Organization. WHO Guidelines on Drawing Blood: Best Practices in Phlebotomy. 3, Blood-sampling systems. World Health Organization. , (2010).
- Raffaelli, B., et al. Plasma calcitonin gene-related peptide (CGRP) in migraine and endometriosis during the menstrual cycle. Annals of Clinical and Translational Neurology. 8 (6), 1251-1259 (2021).
- Andreasson, U., et al. A practical guide to immunoassay method validation. Frontiers in Neurology. 6, 179 (2015).
- Messlinger, K., et al. CGRP measurements in human plasma-a methodological study. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 41 (13), 1359-1373 (2021).
- Sakamoto, S., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. Journal of Natural Medicines. 72 (1), 32-42 (2018).
- Lee, J. -. E., Kim, S. Y., Shin, S. -. Y. Effect of repeated freezing and thawing on biomarker stability in plasma and serum samples. Osong Public Health and Research Perspectives. 6 (6), 357-362 (2015).
- Fan, P. -. C., Kuo, P. -. H., Lee, M. T., Chang, S. -. H., Chiou, L. -. C. Plasma calcitonin gene-related peptide: A potential biomarker for diagnosis and therapeutic responses in pediatric migraine. Frontiers in Neurology. 10, 10 (2019).
- Raffaelli, B., et al. Change of CGRP plasma concentrations in migraine after discontinuation of CGRP-(receptor) monoclonal antibodies. Pharmaceutics. 15 (1), 293 (2023).
