Обнаружение и количественное определение пептида, связанного с геном кальцитонина (CGRP), в плазме крови человека с использованием модифицированного иммуноферментного анализа

Пептид, связанный с геном кальцитонина (CGRP), представляет собой нейропептид из 37 аминокислот, который присутствует в нейронных волокнах с периваскулярной локализацией, а также в ненейрональных тканях. Две формы CGRP, α- и β-CGRP, имеют более 90% гомологии и общие физиологические функции; однако αCGRP обнаруживается в центральной и периферической нервной системе, а βCGRP обнаруживается в энтеральной нервной системе ^1,2. При активации ноцицепторов и кальций-зависимом экзоцитозе CGRP высвобождается из нейронов, вызывая стерильное нейрогенное воспаление, включающее расширение артериальной вазодилатации и экстравазацию белка плазмы 3,4,5,6,7. Отсюда CGRP появляется в посткапиллярных сосудах и может быть биомаркером заболеваний, вызывающих афферентную ноцицептивную активацию, таких как мигрень 8,9,10,11. Следует отметить, что CGRP также участвует в COVID-19 благодаря своей роли в ангиогенезе и иммуномодуляции и может предсказывать неблагоприятное развитие заболевания^12,13. Таким образом, протокол для точного количественного определения CGRP в плазме человека может иметь широкое значение.

Наибольшее внимание, пожалуй, было уделено роли CGRP в мигрени. Основываясь на доклинических и клинических исследованиях, CGRP был выдвинут в качестве возможного биомаркера мигрени и в качестве мишени для лечения 3,4,5,6,7,8,9,10. В некоторых исследованиях было обнаружено повышение CGRP в когортах с эпизодической мигренью по сравнению с контрольными участниками^10,14,15. Успех ингибиторов CGRP в клинических испытаниях для лечения мигрени, по-видимому, подразумевает повышенный CGRP как причинный фактор мигрени. Однако не все исследователи подтвердили эти результаты^16,17,18,19. Более того, роль CGRP в отсутствии головной боли при мигрени еще предстоит выяснить; Данная работа была мотивирована желанием понять роль CGRP в вестибулярных симптомах мигрени.

Противоречивые данные иммуноанализа CGRP в литературе могут быть вызваны несколькими причинами. Во-первых, период полувыведения CGRP в периферической сосудистой сети составляет 6,9 мин 20 из-за активности сериновых протеаз 21, инсулиноразрушающих ферментов и других металлопротеаз 22, нейтральных эндопептидаз 23 и эндотелинпревращающего фермента-1 ²⁴. Во-вторых, переменные технические детали иммунологических анализов, используемых для количественного определения CGRP, не полностью описаны в таких исследованиях. Наконец, отсутствие стандартизации методики иммуноанализа еще больше усложняет картину.

В этой статье описывается модифицированный протокол иммуноферментного анализа (ИФА), который позволяет проводить очистку и точное количественное определение α- и βCGRP в плазме человека. Антитела набора не являются перекрестно реактивными с амилином, кальцитонином или веществом P. Этот протокол прошел необходимые проверочные эксперименты, такие как спайк и восстановление и линейность разбавления, данные по которым представлены здесь. Такой протокол CGRP ELISA, прошедший валидацию, ранее не был полностью описан в литературе. Этот протокол может быть использован для количественной оценки CGRP в плазме человека в контексте мигрени, а также кардиологических^2,25, дерматологических 26, акушерских 27, ревматологических^28,29, скелетно-мышечных 30,31, эндокринных ^32,33 и вирусных заболеваний ^12,13, в которых участвует CGRP.