Floresein-İzotiyosiyanat-Etiketli Dextran Kullanarak Farelerde Bağırsak Bariyer Bütünlüğünün Değerlendirilmesi
Summary
Bu çalışmada, floresein-izotiyosiyanat etiketli (FITC) dekstran, hem in vivo hem de plazma ve dışkı örneklerinde bağırsak geçirgenliğini değerlendirmek için farelere oral gavaj yoluyla uygulanmaktadır. Bağırsak bariyeri fonksiyonu birçok hastalık sürecinde etkilendiğinden, bu doğrudan ve nicel tahlil çeşitli araştırma alanlarında kullanılabilir.
Abstract
Bağırsak bariyeri bütünlüğü, bağırsak sağlığının ayırt edici bir özelliğidir. Bağırsak bariyer bütünlüğü, plazma enflamatuar belirteçlerinin ölçümü ve dalak ve lenf düğümlerine bakteriyel translokasyon gibi dolaylı belirteçler kullanılarak değerlendirilebilirken, altın standart, seçilen moleküllerin bağırsak mukozal tabakasını sistemik dolaşıma doğru geçme yeteneğini doğrudan ölçer. Bu makalede, floresein-izotiyosiyanat etiketli dekstran (FITC-dextran) kullanan farelerde bağırsak geçirgenliğini gerçek zamanlı olarak ölçmek ve takip etmek için invaziv olmayan, uygun maliyetli ve düşük yüklü bir teknik kullanılmaktadır. FITC-dextran ile oral takviyeden önce, fareler oruç tutulur. Daha sonra fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltilmiş FITC-dekstran ile gavagona edilirler. Gavage’den bir saat sonra, fareler izofluran kullanılarak genel anesteziye tabi tutulur ve in vivo floresan bir görüntüleme odasında görselleştirilir. Bu teknik, karın boşluğundaki rezidüel floresanı ve floresan probun portal migrasyonunu düşündüren hepatik alımı değerlendirmeyi amaçlamaktadır. Kan ve dışkı örnekleri oral gavajdan 4 saat sonra toplanır ve fareler kurban edilir. PBS’de seyreltilen plazma ve dışkı örnekleri daha sonra kaplanır ve floresan kaydedilir. FITC-dextran konsantrasyonu daha sonra standart bir eğri kullanılarak hesaplanır. Önceki araştırmalarda, in vivo görüntüleme, düşük lifli bir diyetin neden olduğu daha zayıf bir bağırsak bariyerine sahip farelerde floresanın karaciğere hızla yayıldığını, bağırsak bariyerini güçlendirmek için lifle takviye edilmiş farelerde, floresan sinyalinin çoğunlukla gastrointestinal sistemde tutulduğunu göstermiştir. Ek olarak, bu çalışmada, kontrol fareleri dışkıda yüksek plazma floresansına ve azalmış floresana sahipken, tersine, inülin takviyeli fareler bağırsakta daha yüksek floresan sinyallerine ve plazmada düşük seviyelere sahipti. Özetle, bu protokol bağırsak sağlığı için bir belirteç olarak bağırsak geçirgenliğinin kalitatif ve kantitatif ölçümlerini sağlar.
Introduction
Bağırsak bariyeri hem sağlıkta hem de hastalıkta önemli bir rol oynar. Gerekli besin maddelerinin bağırsak lümeninden dolaşıma nüfuz etmesine izin verirken aynı zamanda patojenler veya antijenler gibi pro-inflamatuar moleküllerin penetrasyonunu önlemek arasında karmaşık bir denge gerektirir1. Artmış geçirgenlik, karaciğer hastalığı veya inflamatuar bağırsak hastalıkları (IBD’ler) gibi birçok gastrointestinal bozukluktan kaynaklanabilir2,3. Örneğin, ülseratif kolitte (UC), bir IBD’de, kronik inflamasyon, sıkı kavşakların parçalanmasına, ardından bağırsak bariyerinin bozulmasına ve bakterilerin translokasyonuna yol açarak, potansiyel olarak mukozal ve sistemik inflamasyonu sürdürür4.
Bu nedenle, bağırsak bariyeri bütünlüğü, bağırsak sağlığının önemli bir belirtecidir. Bununla birlikte, bağırsak geçirgenliğinin ölçülmesi için mevcut yöntemlerin birçok sınırlaması vardır. Örneğin, plazma inflamatuar belirteçlerini veya dalak ve lenf düğümlerine bakteriyel translokasyonu ölçen yöntemler dolaylıolarak 5,6’dır. Diğer yöntemler invaziv ve zaman yoğun olabilir. Bu makalede, bağırsak geçirgenliğini doğrudan ve nicel olarak ölçen invaziv olmayan ve uygun maliyetli bir test açıklanmaktadır. Bu tahlil, floresansı in vivo ölçerek bağırsak geçirgenliğini gerçek zamanlı olarak takip etmek için floresein-izotiyosiyanat etiketli dekstran (FITC-dextran) kullanır. Ek olarak, plazma ve dışkıdaki FITC-dekstran seviyelerinin ölçülmesi, bağırsak geçirgenliğini ölçer (Şekil 1).
FITC-dextran geçirgenlik testi daha önce Parkinson hastalığı7, sepsis8, iskemik inme9 ve yanık hasarı10’un hayvan modelleri de dahil olmak üzere birçok farklı bağlamda kullanılmıştır. Ek olarak, bu tahlil son zamanlarda bağırsak mikrobiyomunun farklı hastalık süreçlerinde nasıl rol oynayabileceğini ve potansiyel bir terapötik olarak nasıl hedeflenebileceğini veya manipüle edilebileceğini anlamaya yardımcı olmak için kullanılmıştır. Örneğin, 11, IBD’ler 12, kolorektal kanser13 ve otizmspektrum bozukluğu 11’de mikrobiyom ve mikrobiyom bazlı terapötikleri incelemek için kullanılmıştır. Bağırsak bariyeri fonksiyonu sağlık ve hastalığın birçok yönüyle ilişkili olduğundan, bu tahlil yaygın olarak kullanılmıştır. Göreceli sadeliği ve düşük zaman yükü, bağırsak bariyeri bütünlüğünü değiştirdiğinden şüphelenilen in vivo koşulları test etmek için idealdir. Kantitatif sonuçları, potansiyel bir tedavinin etkinliğini belirlemek için yararlıdır.
Bu çalışmada, diyetin bağırsak bariyer fonksiyonu üzerindeki etkisi FITC-dextran testi kullanılarak değerlendirilmiştir. Kontrol diyeti alan farelerin bağırsak geçirgenliği ve inülin takviyeli diyet alan farelerin bağırsak geçirgenliği karşılaştırılmıştır. İnülin, bağırsak bariyer fonksiyonunu iyileştirdiği gösterilen faydalı bir oligosakkarittir12,13. İn vivo floresan ölçümleri (arka plan) için, negatif kontrol olarak ek bir tedavi edilmemiş fare kullanıldı ve FITC-dextran yerine PBS aldı. Bu deney, FITC-dekstran testinin bağırsak geçirgenliğini değerlendirmek için değerli bir araç olduğunu göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bağırsak bariyeri fonksiyonu, birçok farklı hastalık sürecinin ayrılmaz bir parçasıdır. Bu nedenle, bağırsak geçirgenliğinin invaziv olmayan, uygun maliyetli ve ölçülebilir bir şekilde değerlendirilmesi, bu hastalıkların hayvan modellerinde doğru bir şekilde temsil edilmesi için gereklidir. FITC-dextran testi bu temsil için olanak sağlar. Bununla birlikte, bu protokol güvenilir sonuçlar elde etmek için doğru bir şekilde tamamlanması gereken birkaç kritik adımı içerir. İlk olarak, uygun boyutta FITC-dextran kullanımının sağlanması esastır. İn vivo geçirgenliği incelemek için, 4 kDa FITC-dextran optimal moleküler ağırlıktır ve moleküler ağırlık arttıkça geçirgenlikazalır 15. Bu nedenle, farklı bir moleküler ağırlığa sahip FITC-dextran kullanmak kafa karıştırıcı veya güvenilmez sonuçlar sağlayabilir. Ek olarak, her bir gavajın zamanını not etmek ve in vivo veri toplama ve plazma ve dışkı toplama için zaman noktalarını buna göre ayarlamak önemlidir. Örneğin, iki fare 10 dakika arayla gavaged edilirse, in vivo floresan okumaları ve dışkı ve plazma toplanması da 10 dakika arayla gerçekleşmelidir. Floresansı aynı zaman noktalarında karşılaştırmak, geçirgenlikteki farklılıkların daha doğru bir şekilde temsil edilmesini sağlar. Ayrıca, farklı gruplardan hayvanların test edilme sırası, zamanlama nedeniyle kümelenme etkisini önlemek için değiştirilmelidir. Önce Grup A’daki tüm hayvanları, daha sonra Grup B saniyesindeki (AAABBB) tüm hayvanları test etmek yerine, grubun her hayvandan (ABABAB) sonra değiştirilmesi önerilir.
Bu tahlil, bir görüntüleme makinesine erişim eksikliği varsa, yalnızca plazma ve dışkı örneklerinin değerlendirilmesini içerecek şekilde değiştirilebilir. Doğrudan floresan görüntüleme in vivo olarak hepatik alımın ve rezidüel abdominal floresanın görüntülenmesine izin vermesine rağmen, plazma ve fekal örneklerdeki floresanın değerlendirilmesi hala bağırsak geçirgenliğinin kantitatif bir ölçümünü sağlar. Ayrıca, tarif edilen deneyde gösterildiği gibi, plazma ve dışkıdaki floresan seviyeleri in vivo görüntüleme ile iyi ilişkilidir. Ek olarak, bu test sadece in vivo görüntülemeyi içerecek şekilde değiştirilebilir. Bu, diğer parametreleri test etmeye devam etmek veya bağırsak geçirgenliğinin zaman içinde nasıl değiştiğini izlemek için hayvanların canlı tutulmasını sağlar. Bu nedenle, bu tahlili değiştirme yeteneği, onu erişilebilir, ancak yine de niceliksel hale getirir. Son olarak, her fareye verilen 80 mg · mL − 1 FITC-dekstran’ın 200 μL’lik dozu daha önce kullanılmış ve vücut ağırlığında küçük farklılıklar olan farelerde etkili olduğu gösterilmiştir16. Ayrıca, temsili sonuçlar bölümünde kullanılan tüm farelerin yaklaşık 20 g ağırlığında olduğunu ve her fare için aynı dozajın kullanılmasına izin verdiğini belirtmek önemlidir. Bununla birlikte, vücut ağırlığındaki farklılıkları hesaba katmak için, FITC-dextran, örneğin17 gibi 0.6-0.8 mg / g vücut ağırlığındaki bir dozajda uygulanabilir. En önemlisi, kullanılan dozajdan bağımsız olarak, komplikasyonları veya rahatsızlığı önlemek için her fareye verilen miktarı 10 mL · kg − 1’den daha az bir miktarla sınırlamak önemlidir18.
FITC-dextran testi, bağırsak bariyer fonksiyonunu değerlendirmek için etkili bir yöntem sağlasa da, yine de bazı sınırlamaları vardır. Bu modelin bir sınırlaması, fareleri birkaç saat boyunca oruç tutmayı gerektirmesidir, yani bu sonuçları oruç tutmamış farelerden elde edilenlerle karşılaştırmak güvenilmezdir. Ek olarak, oruç, diyabet için hayvan modellerinde kan şekeri ölçümü gibi sıkı beslenme programları gerektiren bazı modellerdeki sonuçları etkileyebilir.
Bu sınırlamalara rağmen, FITC-dekstran testi, birçok klasik yöntemden daha kantitatif, çok yönlü, uygun maliyetli ve daha az invaziv olduğu için bağırsak geçirgenliğini analiz etmek için etkili bir yöntem olmaya devam etmektedir. Örneğin, bağırsak geçirgenliğini ölçmek için kullanılan yaygın problar, bazı avantajları olan küçük sakarit problar veya Cr-EDTA’dır19. Bununla birlikte, bazı sakkarit probları sadece bölgeye özgü geçirgenliğe sahiptir. İnce bağırsağın distal kısmında hidrolize olduklarından, kolonik geçirgenlik hakkında hiçbir fikir vermezler19. Öte yandan, Cr-EDTA kolonik geçirgenlik hakkında bilgi sağlayabilir, ancak 24 saat boyunca ölçümler gerektirir, bu da bu yöntemin zaman yükünü FITC-dekstran testi20’ninkinden çok daha yüksek hale getirir. Ayrıca, bu yöntemlerin hiçbiri bu testin doğrudan in vivo görüntülenmesini sağlamaz. Bu nedenle, FITC-dextran testi, bağırsak geçirgenliğini ölçmek için alternatif yöntemlere kıyasla nispeten basit, doğrudan ve etkili bir seçenek sunar.
Son olarak, IBD4, Alzheimer hastalığı21 ve karaciğer hastalığı2 gibi hastalık süreçlerinde, bağırsak geçirgenliği, çalışmaları iyileştirmek için FITC-dekstran testi kullanılarak ölçülebilecek önemli bir parametredir. Örneğin, IBD’ler için immünoterapiler gibi yeni tedavilerin geliştirilmesinde, bu tahlil, bağırsak bariyeri bütünlüğünü korumak için terapinin etkinliğini test etmek için kullanılabilir. Bozulmuş bağırsak bariyeri fonksiyonunun UC’deki kronik inflamasyonun sürdürülmesinde rol oynayabileceği göz önüne alındığında, örneğin, bir terapinin artan geçirgenliğe karşı ne kadar iyi korunduğunu incelemek önemlidir4. Bu sadece bir örnektir, ancak FITC-dextran testi, araştırmanın birçok farklı alanında ve yönüyle bağırsak geçirgenliğini ölçmenin erişilebilir ve ölçülebilir bir yoludur.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi’nden bir hibe ile finanse edilmiştir (MMS’ye RGPIN-2018-06442 hibesi). CRCHUM’daki hayvan tesisine ve Kardiyovasküler Fenotipleme Platformundan Dr. Junzheng Peng’e teşekkür ederiz.
Materials
| 50 ppm Fe Diet (10% Inulin) | Envigo Teklad | TD.190651 | Representative Results |
| 50 ppm Fe Diet (FeSO4) | Envigo Teklad | TD.190723 | Representative Results |
| BALB/c Mice 49-55 Days, Female | Charles River | 028BALB/C | Representative Results |
| BD 1 mL Syringe Tuberculin Slip Tip | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For gavage |
| BD Microtainer Tubes – With LH (Lithium Heparin) | Becton, Dickinson and Company | 365965 | For plasma collection |
| Centrifuge 5420 | Eppendorf | S420KN605698 | |
| Curved Gavage Needle (Gavage Cannula) 7.7.0 38 mm x 22 G | Harvard Apparatus Canada | 34-024 | No longer available – A potential alternative is available at Instech Labs (FTP-22-38) |
| Euthanyl (Pentobarbital Sodium) 240 mg/mL | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 141704 | 1/100 dilution; Administered via intraperitoneal injection at 0.03 mL/g body weight |
| FITC-dextran 4 | TdB Labs | 20550 | |
| Heparinized Capillary Tubes | Kimble Chase Life Science and Research | 2501 | For retro-orbital blood collection |
| Microplate, PS, 96-well, Flat-bottom (Chimney Well), Black, Flutrac, Med. Binding | Greiner Bio-one | 655076 | |
| MiniARCO Clipper Kit | Kent Scientific | CL8787-KIT | For hair removal |
| Optix MX2 and Optix Optiview | Advanced Research Technologies | 2.02.00.6 | Fluorescence imaging machine and software |
| Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Wisent Inc | 311-010-LL | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | 12920060 | Ophthalmic ointement to prevent eye damage during anesthesia |
| Spark Multiplate Reader | Tecan | 30086376 |
References
- König, J., et al. Human intestinal barrier function in health and disease. Clinical and Translational Gastroenterology. 7 (10), 196 (2016).
- Lorenzo-Zuniga, V., et al. Insulin-like growth factor I improves intestinal barrier function in cirrhotic rats. Gut. 55 (9), 1306-1312 (2006).
- Schwarz, B. T., et al. LIGHT signals directly to intestinal epithelia to cause barrier dysfunction via cytoskeletal and endocytic mechanisms. Gastroenterology. 132 (7), 2383-2394 (2007).
- Schmitz, H., et al. Altered tight junction structure contributes to the impaired epithelial barrier function in ulcerative colitis. Gastroenterology. 116 (2), 301-309 (1999).
- Fouts, D. E., Torralba, M., Nelson, K. E., Brenner, D. A., Schnabl, B. Bacterial translocation and changes in the intestinal microbiome in mouse models of liver disease. Journal of Hepatology. 56 (6), 1283-1292 (2012).
- Galipeau, H. J., Verdu, E. F. The complex task of measuring intestinal permeability in basic and clinical science. Neurogastroenterology and Motility. 28 (7), 957-965 (2016).
- Bordoni, L., et al. Positive effect of an electrolyzed reduced water on gut permeability, fecal microbiota and liver in an animal model of Parkinson’s disease. PLoS One. 14 (10), 0223238 (2019).
- Wang, Q., Fang, C. H., Hasselgren, P. -. O. Intestinal permeability is reduced and IL-10 levels are increased in septic IL-6 knockout mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 281 (3), 1013-1023 (2001).
- Crapser, J., et al. Ischemic stroke induces gut permeability and enhances bacterial translocation leading to sepsis in aged mice. Aging. 8 (5), 1049-1063 (2016).
- Mal Earley, Z., et al. Burn injury alters the intestinal microbiome and increases gut permeability and bacterial translocation. PLoS One. 10 (7), 0129996 (2015).
- Sharon, G., et al. Human gut microbiota from autism spectrum disorder promote behavioral symptoms in mice. Cell. 177 (6), 1600-1618 (2019).
- Schroeder, B. O., et al. Bifidobacteria or fiber protects against diet-induced microbiota-mediated colonic mucus deterioration. Cell Host & Microbe. 23 (1), 27-40 (2018).
- Hajjar, R., et al. Improvement of colonic healing and surgical recovery with perioperative supplementation of inulin and galacto-oligosaccharides. Clinical Nutrition. 40 (6), 3842-3851 (2021).
- JoVE. Lab Animal Research. Blood Withdrawal I. JoVE Science Education Database. , (2022).
- Costantini, T. W., et al. Quantitative assessment of intestinal injury using a novel in vivo, near-infrared imaging technique. Molecular Imaging. 9 (1), 30-39 (2010).
- Thevaranjan, N., et al. Age-associated microbial dysbiosis promotes intestinal permeability, systemic inflammation, and macrophage dysfunction. Cell Host & Microbe. 21 (4), 455-466 (2017).
- Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. Current Protocols in Immunology. 104, 1-14 (2014).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
- Arrieta, M. C., Bistritz, L., Meddings, J. B. Alterations in intestinal permeability. Gut. 55 (10), 1512-1520 (2006).
- von Martels, J. Z. H., Bourgonje, A. R., Harmsen, H. J. M., Faber, K. N., Dijkstra, G. Assessing intestinal permeability in Crohn’s disease patients using orally administered 52Cr-EDTA. PLoS One. 14 (2), 0211973 (2019).
- Gonzalez-Escamilla, G., Atienza, M., Garcia-Solis, D., Cantero, J. L. Cerebral and blood correlates of reduced functional connectivity in mild cognitive impairment. Brain Structure and Function. 221 (1), 631-645 (2016).
