Avaliação da integridade da barreira intestinal em camundongos usando Dextrano marcado com fluoresceína-isotiocianato
Summary
No presente estudo, o dextrano marcado com fluoresceína-isotiocianato (FITC) é administrado a camundongos via gavagem oral para avaliar a permeabilidade intestinal tanto in vivo quanto em amostras plasmáticas e fecais. Como a função de barreira intestinal é afetada em muitos processos de doenças, este ensaio direto e quantitativo pode ser usado em diversas áreas de pesquisa.
Abstract
A integridade da barreira intestinal é uma característica da saúde intestinal. Embora a integridade da barreira intestinal possa ser avaliada usando marcadores indiretos, como a medição de marcadores inflamatórios plasmáticos e a translocação bacteriana para o baço e os gânglios linfáticos, o padrão-ouro quantifica diretamente a capacidade das moléculas selecionadas de atravessar a camada mucosa intestinal em direção à circulação sistêmica. Este artigo usa uma técnica não invasiva, econômica e de baixa carga para quantificar e acompanhar em tempo real a permeabilidade intestinal em camundongos usando dextrano marcado com fluoresceína-isotiocianato (FITC-dextrano). Antes da suplementação oral com FITC-dextrano, os ratos estão em jejum. Eles são então gavagados com FITC-dextran diluído em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Uma hora após a gavagem, os camundongos são submetidos à anestesia geral com isoflurano, e a fluorescência in vivo é visualizada em uma câmara de imagem. Esta técnica tem como objetivo avaliar a fluorescência residual na cavidade abdominal e a captação hepática, o que é sugestivo de migração portal da sonda fluorescente. Amostras de sangue e fezes são coletadas 4 h após a gavagem oral, e os ratos são sacrificados. Amostras de plasma e fezes diluídas em PBS são então chapeadas e a fluorescência é registrada. A concentração de FITC-dextran é então calculada usando uma curva padrão. Em pesquisas anteriores, imagens in vivo mostraram que a fluorescência se espalha rapidamente para o fígado em camundongos com uma barreira intestinal mais fraca induzida por uma dieta pobre em fibras, enquanto em camundongos suplementados com fibras para fortalecer a barreira intestinal, o sinal fluorescente é retido principalmente no trato gastrointestinal. Além disso, neste estudo, os ratos de controle tiveram fluorescência plasmática elevada e fluorescência reduzida nas fezes, enquanto inversamente, os ratos suplementados com inulina apresentaram níveis mais altos de sinais de fluorescência no intestino e baixos níveis no plasma. Em resumo, este protocolo fornece medidas qualitativas e quantitativas da permeabilidade intestinal como marcador para a saúde intestinal.
Introduction
A barreira intestinal desempenha um papel importante na saúde e na doença. Requer um equilíbrio complexo entre permitir que os nutrientes necessários permeiem a circulação a partir do lúmen intestinal e, ao mesmo tempo, impedir a penetração de moléculas pró-inflamatórias, como patógenos ou antígenos1. O aumento da permeabilidade pode ser causado por muitos distúrbios gastrointestinais, como doença hepática ou doenças inflamatórias intestinais (DIIs)2,3. Por exemplo, na colite ulcerativa (RCU), uma DII, a inflamação crônica leva à quebra de junções apertadas, à subsequente ruptura da barreira intestinal e à translocação de bactérias, potencialmente perpetuando a inflamação mucosa e sistêmica4.
A integridade da barreira intestinal é, portanto, um importante marcador da saúde intestinal. No entanto, os métodos atuais para a medição da permeabilidade intestinal têm muitas limitações. Por exemplo, métodos que medem marcadores inflamatórios plasmáticos ou translocação bacteriana para o baço e linfonodos são indiretos 5,6. Outros métodos podem ser invasivos e demorados. Este artigo descreve um ensaio não invasivo e custo-efetivo que mede direta e quantitativamente a permeabilidade intestinal. Este ensaio usa dextrano marcado com fluoresceína-isotiocianato (FITC-dextrano) para acompanhar a permeabilidade intestinal em tempo real, medindo a fluorescência in vivo. Além disso, a mensuração dos níveis de FITC-dextrano no plasma e nas fezes quantifica a permeabilidade intestinal (Figura 1).
O ensaio de permeabilidade FITC-dextran tem sido usado anteriormente em muitos contextos diferentes, inclusive em modelos animais da doença de Parkinson7, sepse8, acidente vascular cerebral isquêmico9 e lesão por queimadura10. Além disso, este ensaio tem sido usado recentemente para ajudar na compreensão de como o microbioma intestinal pode estar implicado em diferentes processos de doença e como ele pode ser direcionado ou manipulado como uma terapêutica potencial. Por exemplo, tem sido usado para estudar o microbioma e a terapêutica baseada no microbioma no envelhecimento 11, DIIs12, câncer colorretal 13 e transtorno do espectro do autismo11. Como a função de barreira intestinal está implicada em vários aspectos da saúde e da doença, este ensaio tem sido amplamente utilizado. Sua relativa simplicidade e baixa carga de tempo o tornam ideal para testar as condições in vivo suspeitas de alterar a integridade da barreira intestinal. Seus resultados quantitativos são úteis para determinar a eficácia de um tratamento potencial.
Neste estudo, o efeito da dieta sobre a função da barreira intestinal foi avaliado usando o ensaio FITC-dextran. A permeabilidade intestinal de camundongos que receberam uma dieta de controle e a permeabilidade intestinal de camundongos que receberam uma dieta suplementada com inulina foram comparadas. A inulina é um oligossacarídeo benéfico que demonstrou melhorar a função da barreira intestinal12,13. Para medições de fluorescência in vivo (fundo), um camundongo adicional não tratado foi usado como controle negativo e recebeu PBS em vez de FITC-dextrano. Este experimento demonstra que o ensaio FITC-dextran é uma ferramenta valiosa para avaliar a permeabilidade intestinal.
Protocol
Representative Results
Discussion
A função de barreira intestinal é parte integrante de muitos processos de doenças diferentes. Assim, avaliar a permeabilidade intestinal de forma não invasiva, custo-efetiva e quantificável é essencial para representar com precisão essas doenças em modelos animais. O ensaio FITC-dextran oferece a possibilidade para essa representação. No entanto, esse protocolo envolve várias etapas críticas que devem ser concluídas com precisão para obter resultados confiáveis. Em primeiro lugar, é essencial assegurar a utilização de FITC-dextran de dimensões adequadas. Para examinar a permeabilidade in vivo , 4 kDa FITC-dextran é o peso molecular ideal e, à medida que o peso molecular aumenta, a permeabilidade diminui15. Assim, o uso de FITC-dextran de um peso molecular diferente pode fornecer resultados confusos ou não confiáveis. Além disso, é importante observar o tempo de cada gavagem e ajustar os pontos de tempo para a coleta de dados in vivo e a coleta de plasma e fezes de acordo. Por exemplo, se dois ratos são gavagados a 10 minutos de distância, as leituras de fluorescência in vivo e a coleta de fezes e plasma também devem ocorrer com 10 minutos de intervalo. Comparar a fluorescência nos mesmos pontos de tempo permite uma representação mais precisa das diferenças de permeabilidade. Além disso, a ordem em que os animais de diferentes grupos são testados deve ser alternada para evitar um efeito de agrupamento devido ao tempo. Em vez de testar todos os animais do Grupo A primeiro, depois todos os animais do Grupo B segundo (AAABBB), recomenda-se que o grupo seja trocado após cada animal (ABABAB).
Este ensaio pode ser modificado para incluir apenas a avaliação de amostras de plasma e fezes se houver falta de acesso a uma máquina de imagem. Embora a imagem de fluorescência direta in vivo permita a visualização da ingestão hepática e da fluorescência abdominal residual, a avaliação da fluorescência nas amostras plasmáticas e fecais ainda fornece uma medida quantitativa da permeabilidade intestinal. Além disso, como demonstrado pelo experimento descrito, os níveis de fluorescência no plasma e nas fezes se correlacionam bem com a imagem in vivo. Além disso, este ensaio pode ser modificado para incluir apenas a imagem in vivo. Isso permite que os animais sejam mantidos vivos para continuar testando outros parâmetros ou monitorar como a permeabilidade intestinal muda ao longo do tempo. A capacidade de modificar esse ensaio, portanto, o torna acessível, mas ainda quantitativo. Finalmente, a dosagem de 200 μL de 80 mg·mL−1 FITC-dextran administrada a cada camundongo foi utilizada anteriormente e mostrou-se eficaz em camundongos com pequenas diferenças no peso corporal16. Além disso, é importante notar que todos os camundongos utilizados na seção de resultados representativos pesaram aproximadamente 20 g, permitindo que a mesma dosagem fosse usada para cada rato. Para explicar as diferenças no peso corporal, no entanto, o FITC-dextran pode ser administrado na dose de 0,6-0,8 mg / g de peso corporal, por exemplo,17. Crucialmente, independentemente da dosagem utilizada, é importante limitar a quantidade gavada para cada camundongo a menos de 10 mL·kg−1 para evitar complicações ou desconforto18.
Embora o ensaio FITC-dextran forneça um método eficaz para avaliar a função da barreira intestinal, ele ainda tem algumas limitações. Uma limitação deste modelo é que ele requer o jejum dos ratos por várias horas, o que significa que não é confiável comparar esses resultados com os de ratos que não foram jejuados. Além disso, o jejum pode afetar os resultados em certos modelos que exigem horários de alimentação rigorosos, como ao medir a glicose no sangue em modelos animais para diabetes.
Apesar dessas limitações, o ensaio FITC-dextran continua sendo um método eficaz para analisar a permeabilidade intestinal, pois é quantitativo, versátil, econômico e menos invasivo do que muitos métodos clássicos. Por exemplo, sondas comuns utilizadas para medir a permeabilidade intestinal são as pequenas sondas de sacarídeo ou Cr-EDTA, que apresentam algumas vantagens19. No entanto, algumas sondas de sacarídeo têm apenas permeabilidade específica da região. Como são hidrolisados na porção distal do intestino delgado, não fornecem informações sobre a permeabilidade colônica19. Por outro lado, o Cr-EDTA pode fornecer informações sobre a permeabilidade colônica, mas requer medições por 24 h, tornando a carga de tempo deste método muito maior do que a do ensaio FITC-dextran20. Além disso, nenhum desses métodos fornece a imagem in vivo direta deste ensaio. Portanto, o ensaio FITC-dextran fornece uma opção relativamente simples, direta e eficaz em comparação com métodos alternativos para medir a permeabilidade intestinal.
Finalmente, em processos patológicos como as DIIs4, a doença de Alzheimer21 e a doença hepática2, a permeabilidade intestinal é um parâmetro importante que pode ser medido usando o ensaio FITC-dextran para melhorar os estudos. Por exemplo, no desenvolvimento de novos tratamentos, como imunoterapias para DIIs, este ensaio pode ser usado para testar a eficácia da terapêutica para manter a integridade da barreira intestinal. Considerando que a função de barreira intestinal prejudicada pode estar implicada na perpetuação da inflamação crônica na RCU, por exemplo, examinar o quão bem uma terapêutica protege contra o aumento da permeabilidade é importante4. Este é apenas um exemplo, mas o ensaio FITC-dextran é uma maneira acessível e quantificável de medir a permeabilidade intestinal em muitas áreas e aspectos diferentes da pesquisa.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por uma bolsa do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (concessão RGPIN-2018-06442 ao MMS). Agradecemos à instalação de animais no CRCHUM e ao Dr. Junzheng Peng da Plataforma de Fenotipagem Cardiovascular.
Materials
| 50 ppm Fe Diet (10% Inulin) | Envigo Teklad | TD.190651 | Representative Results |
| 50 ppm Fe Diet (FeSO4) | Envigo Teklad | TD.190723 | Representative Results |
| BALB/c Mice 49-55 Days, Female | Charles River | 028BALB/C | Representative Results |
| BD 1 mL Syringe Tuberculin Slip Tip | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For gavage |
| BD Microtainer Tubes – With LH (Lithium Heparin) | Becton, Dickinson and Company | 365965 | For plasma collection |
| Centrifuge 5420 | Eppendorf | S420KN605698 | |
| Curved Gavage Needle (Gavage Cannula) 7.7.0 38 mm x 22 G | Harvard Apparatus Canada | 34-024 | No longer available – A potential alternative is available at Instech Labs (FTP-22-38) |
| Euthanyl (Pentobarbital Sodium) 240 mg/mL | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 141704 | 1/100 dilution; Administered via intraperitoneal injection at 0.03 mL/g body weight |
| FITC-dextran 4 | TdB Labs | 20550 | |
| Heparinized Capillary Tubes | Kimble Chase Life Science and Research | 2501 | For retro-orbital blood collection |
| Microplate, PS, 96-well, Flat-bottom (Chimney Well), Black, Flutrac, Med. Binding | Greiner Bio-one | 655076 | |
| MiniARCO Clipper Kit | Kent Scientific | CL8787-KIT | For hair removal |
| Optix MX2 and Optix Optiview | Advanced Research Technologies | 2.02.00.6 | Fluorescence imaging machine and software |
| Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Wisent Inc | 311-010-LL | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | 12920060 | Ophthalmic ointement to prevent eye damage during anesthesia |
| Spark Multiplate Reader | Tecan | 30086376 |
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