הערכה של שלמות מחסום המעי בעכברים באמצעות דקסטרן עם תווית פלואורסצאין-איזותיוציאנט

כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים לאחר אישור הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים של CRCHUM. נקבות עכברי BALB/c בנות שמונה שבועות, שהתקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים), שימשו במחקר הנוכחי. בעלי החיים קיבלו תוסף תזונה עם 10% אינולין wt/wt במשך שבועיים. קבוצת ביקורת קיבלה תזונה דומה ללא תוסף אינולין. לעכברים הייתה גישה אד-ליביטום . סקירה כללית של הבדיקה מוצגת באיור 1. איור 1: סכמטי של בדיקת FITC-dextern. T − 4 – 4 שעות לפני gavage, גישה למזון הוסרה. T0- FITC-dextran ניתן באמצעות gavage אוראלי. T1 – 1 h לאחר gavage, הפלואורסצנטיות in vivo הוערכה. T4- 4 שעות לאחר הפרסום, נאספו דגימות הצואה והפלזמה, ונמדדה הפלואורסצנטיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. 1. ניהול FITC-dextran לפני מתן FITC-dextran, צמו את העכברים במשך 4 שעות תוך שמירה על גישה למים.הערה: רצוי להתחיל את הצום בתחילת מחזור האור (בבוקר). ניתן להעביר את העכברים לכלוב חדש ללא מצעים במהלך הצום כדי להגביל את הקופרופגיה. הכן 200 μL של 80 מ”ג·מ”ל−1 4 kDa FITC-dextran (ראה טבלת חומרים) מדולל במי מלח סטריליים 1x פוספט חוצץ (PBS) (לכל עכבר). הכינו את הדגימות מיד לפני מתן התרופה, ושמרו עליהן מוגנות מפני אור. יש לתת 200 μL של מתלה FITC-dextran באמצעות gavage אוראלי לכל עכבר באמצעות מחט gavage מעוקלת 38 מ”מ 22 G מעוקלת עם קצה בצורת כדור או אגס (ראה טבלת חומרים). הפעל טיימר לאחר ה- gavage הראשון, והמתן 5-10 דקות לפני שתפעיל את העכבר הבא כדי לאפשר מדידות in vivo (שלב 2), תוך שמירה תמיד על שעה אחת לאחר ה- gavage. שמור על מתלי FITC-dextran הנותרים עבור העקומה הסטנדרטית.הערה: מיד לאחר ההדבקה, מזון עשוי להיות מוחלף כדי להבטיח היווצרות של צואה. 2. מדידת פלואורסצנטיות In vivo מרדימים את העכברים שעה לאחר ההרדמה באמצעות איזופלורן 2.5% או חומר הרדמה חלופי. ודא כי בעל החיים מורדם כראוי על ידי צביטת הבוהן או הזנב ולוודא כי בעל החיים אינו מגיב.יש להסיר את הפרווה מאזור הבטן באמצעות מכונת גילוח חשמלית, ולמרוח בנדיבות משחת סיכה אופתלמית על העיניים כדי למנוע התייבשות. לאחר מכן, הניחו את העכברים בנפרד בתא ההדמיה בשכיבה גבית.הערה: יש לכלול עכבר בקרה אחד שמקבל PBS או מלוחים במקום FITC-dextran כדי לקחת בחשבון את הרקע במהלך הדמיה in vivo . דמיינו את העכברים באמצעות תא הדמיה פלואורסצנטי (ראו טבלת חומרים). לרכוש תמונות של אזור הבטן, הגדרת אורך הלייזר ב 470 ננומטר ואת הרזולוציה ב 2.0 מ”מ.הפעל את המחשב והתוכנה על-ידי לחיצה ממושכת על לחצן התחל . אפשרו למערכת להתחמם.הערה: ייתכן שהמערכת תזדקק ל-20 דקות או יותר כדי להתחמם, ולכן יש להפעיל את המכשיר מוקדם כדי לא להפריע להדמיה של העכברים בשעה אחת לאחר ההתחממות. לחץ על מצב התקן וודא שכל המכשירים המוגדרים מציגים “אישור” לפני שתמשיך. במידת הצורך, חממו את הלייזר המתאים על ידי לחיצה על בקרת לייזר ולאחר מכן לחיצה על כפתור שם הלייזר של הלייזר הרצוי. התחל מחקר חדש על ידי לחיצה על מחקר חדש. שמור תחת הקובץ המתאים בשם הרצוי. לחץ על אפשרויות מחקר, ואז הזן את מזהה הדגימה, ובחר את הלייזר והניסוי הנכון. פתח את תא ההדמיה והנח את בעל החיים באופן דורסלי על צלחת הסריקה. אבטחו את הגפיים והזנב בעזרת נייר דבק, וודאו שהאף והפה משתלבים היטב בצינור ההרדמה, תוך שמירה על איזופלורן של 2.5%. כוונן את גובה לוח הסריקה כך שאזור הסריקה יהיה מעט גחוני מקו האמצע של החיה. כוונן את הלוח על-ידי סיבוב ידית הכוונון בתוך תא ההדמיה. סגור ונעל את דלת תא ההדמיה. בחרו באזור לסריקה בעזרת הכלי ציור . כלול את כל רוחב הבטן ממש מעל הכבד ועד פי הטבעת. לחץ על הכלי שינוי כדי להתאים את האזור לאחר הציור. הגדר את רזולוציית הסריקה ל- 2.0 מ”מ ולאחר מכן לחץ על הבא. לאחר השלמת אוטומציית צריכת החשמל, ודא שההגדרות נכונות ובצע את כל ההתאמות הדרושות. לחץ על התחל כדי להתחיל בסריקה. לאחר השלמת הסריקה, הוציאו את בעל החיים מתא ההדמיה, והניחו אותו באינקובטור כדי לשמור על טמפרטורת הגוף בזמן ההתאוששות מההרדמה. לחץ על המשך המחקר כדי לשמור על ההגדרות ולאחר מכן חזור על שלבים 2.2.5-2.2.10 עד שכל העכברים ייסרקו. לחץ על לחצן ההפעלה והחזק אותו למשך 3 שניות כדי לכבות את תא ההדמיה. הערך את הפלואורסצנטיות על-ידי השוואת פלואורסצנטיות הבטן של כל בעל חיים ועכבר הבקרה בתמונות בקנה מידה אחיד באמצעות תוכנה המשויכת למערכת ההדמיה שבה נעשה שימוש (ראה טבלת חומרים).פתח את קבצי התמונה על ידי מציאתם תחת שם הקובץ שנבחר. פתח את כל הקבצים בעלי הגדרות מסונכרנות בו-זמנית. באמצעות סרגל הכלים של הגדרות התמונה, השתמש בלחצנים סנכרן תמונה וסנכרן קנה מידה כדי לסנכרן את ההגדרות עבור התמונות, ולאפשר השוואה מדויקת. שמרו את התמונות עם קנה המידה המותאם שלהן. 3. מדידת פלואורסצנטיות בדגימות צואה ובפלזמה לאסוף כדור צואה מכל עכבר בצינור סטרילי 4 שעות לאחר gavage. שמור את הצינורות בחושך על קרח. הרדימו את העכברים באמצעות הזרקה תוך-צפקית של 240 מ”ג/מ”ל נתרן פנטוברביטל (דילול, 1:100; ראו טבלת חומרים). יש לתת במינון של 0.03 מ”ל/גרם משקל גוף.יש לאסוף דגימות דם של לפחות 700 μL בצינור המיועד לאיסוף פלזמה המכיל הפרין או EDTA למניעת קרישיות (ראה טבלת חומרים) על ידי החדרת צינור נימי זכוכית למקלעת רטרו-אורביטלית14.הערה: שיטות חלופיות לאיסוף דם כוללות ניקוב לב או נסיגה מווריד הזנב. מכיוון שמדובר בהליך סופני, יש להרדים את העכברים באמצעות פריקת צוואר הרחם או שיטה הומנית חלופית. עקוב אחר המלצות ועדת האתיקה המקומית של בעלי חיים להמתת חסד. צנטריפוגה את דגימות הדם ב 9,390 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. העבירו את הפלזמה לצינור סטרילי חדש, ושמרו אותה בחושך על קרח. לדלל 50 מ”ג של דגימות צואה ב 200 μL של 1x PBS ולדלל את הפלזמה 1: 2 עם 1x PBS. ניתן לשנות את יחס הדילול בהתבסס על עוצמת האות הפלואורסצנטי. צור עקומה סטנדרטית באמצעות דילולים סדרתיים של FITC-dextran ב- 1x PBS. החל מהריכוז הגבוה ביותר של 20 מ”ג·מ”ל−1 FITC דקסטרן, יש לדלל פי 1:1 באופן סדרתי 7-10 פעמים.הערה: הריכוזים, אם כן, חייבים לקרוא 20 מ”ג·מ”ל−1, 10 מ”ג·מ”ל−1, 5 מ”ג·מ”ל−1, 2.5 מ”ג·מ”ל−1, 1.25 מ”ג·מ”ל−1, 0.625 מ”ג·מ”ל−1, 0.3125 מ”ג·מ”ל−1 וכו’. צלחת 100 μL דוגמאות ותקנים בצלחת שחורה אטומה 96 בארות. כלול PBS ריק. קרא את הפלואורסצנטיות בקורא לוחות פלואורסצנטיים (ראה טבלת חומרים) עם ספיגה ב 530 ננומטר ועירור ב 485 ננומטר.הערה: ניתן לצפות את הדגימות והתקנים בצורה כפולה או משולשת, ולאחר מכן ערכי הפלואורסצנטיות שלהם ממוצעים. קבע את הריכוז של FITC-דקסטרן לדגימה על ידי השוואת הפלואורסצנטיות לריכוזים הידועים של העקומה הסטנדרטית. בדגימות, מכפילים את הריכוז בגורם הדילול (שלב 3.5).