تقييم سلامة حاجز الأمعاء في الفئران باستخدام ديكستران المسمى بالفلوريسئين أيزوثيوسيانات
Summary
في هذه الدراسة ، يتم إعطاء ديكستران المسمى بالفلوريسئين أيزوثيوسيانات (FITC) للفئران عن طريق التزويج الفموي لتقييم نفاذية الأمعاء في كل من الجسم الحي وفي عينات البلازما والبراز. نظرا لأن وظيفة حاجز الأمعاء تتأثر في العديد من عمليات المرض ، يمكن استخدام هذا الفحص المباشر والكمي في مجالات بحثية متنوعة.
Abstract
سلامة حاجز الأمعاء هي السمة المميزة لصحة الأمعاء. بينما يمكن تقييم سلامة حاجز الأمعاء باستخدام علامات غير مباشرة مثل قياس علامات التهاب البلازما والانتقال البكتيري إلى الطحال والغدد الليمفاوية ، فإن المعيار الذهبي يحدد بشكل مباشر قدرة الجزيئات المختارة على اجتياز الطبقة المخاطية للأمعاء نحو الدورة الدموية الجهازية. تستخدم هذه المقالة تقنية غير جراحية وفعالة من حيث التكلفة ومنخفضة العبء لتحديد ومتابعة نفاذية الأمعاء في الفئران في الوقت الفعلي باستخدام ديكستران المسمى بالفلوريسئين أيزوثيوسيانات (FITC-dextran). قبل تناول المكملات الفموية مع FITC-dextran ، يتم صيام الفئران. ثم يتم تقشيرها باستخدام FITC-dextran المخفف في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). بعد ساعة واحدة من التزويج ، تخضع الفئران للتخدير العام باستخدام الأيزوفلوران ، ويتم تصور التألق في الجسم الحي في غرفة التصوير. تهدف هذه التقنية إلى تقييم التألق المتبقي في تجويف البطن والامتصاص الكبدي ، مما يوحي بالهجرة البابية لمسبار الفلورسنت. يتم جمع عينات الدم والبراز بعد 4 ساعات من التزويج الفموي ، ويتم التضحية بالفئران. ثم يتم طلاء عينات البلازما والبراز المخففة في برنامج تلفزيوني ، ويتم تسجيل التألق. ثم يتم حساب تركيز FITC-dextran باستخدام منحنى قياسي. في الأبحاث السابقة ، أظهر التصوير في الجسم الحي أن التألق ينتشر بسرعة إلى الكبد في الفئران ذات حاجز الأمعاء الأضعف الناجم عن نظام غذائي منخفض الألياف ، بينما في الفئران المكملة بالألياف لتقوية حاجز الأمعاء ، يتم الاحتفاظ بإشارة الفلورسنت في الغالب في الجهاز الهضمي. بالإضافة إلى ذلك ، في هذه الدراسة ، كان لدى الفئران الضابطة مضان مرتفع في البلازما وانخفاض مضان في البراز ، بينما عكسيا ، كان لدى الفئران المكملة بالأنسولين مستويات أعلى من إشارات التألق في الأمعاء ومستويات منخفضة في البلازما. باختصار ، يوفر هذا البروتوكول قياسات نوعية وكمية لنفاذية الأمعاء كعلامة على صحة الأمعاء.
Introduction
يلعب حاجز الأمعاء دورا مهما في كل من الصحة والمرض. يتطلب توازنا معقدا بين السماح للعناصر الغذائية المطلوبة بالتغلغل في الدورة الدموية من تجويف الأمعاء مع منع تغلغل الجزيئات المؤيدة للالتهابات في نفس الوقت ، مثل مسببات الأمراض أو المستضدات1. يمكن أن تحدث زيادة النفاذية بسبب العديد من اضطرابات الجهاز الهضمي ، مثل أمراض الكبد أو أمراض الأمعاء الالتهابية (IBDs)2,3. على سبيل المثال ، في التهاب القولون التقرحي (UC) ، وهو مرض التهاب الأمعاء ، يؤدي الالتهاب المزمن إلى انهيار الوصلات الضيقة ، والاضطراب اللاحق لحاجز الأمعاء ، ونقل البكتيريا ، مما قد يؤدي إلى إدامة الالتهاب المخاطي والجهازي4.
وبالتالي ، فإن سلامة حاجز الأمعاء هي علامة مهمة على صحة الأمعاء. ومع ذلك ، فإن الطرق الحالية لقياس نفاذية الأمعاء لها العديد من القيود. على سبيل المثال ، طرق قياس علامات التهاب البلازما أو الانتقال البكتيري إلى الطحال والغدد الليمفاوية غير مباشرة 5,6. يمكن أن تكون الطرق الأخرى غازية وتستغرق وقتا طويلا. توضح هذه المقالة مقايسة غير جراحية وفعالة من حيث التكلفة تقيس نفاذية الأمعاء بشكل مباشر وكمي. يستخدم هذا الفحص ديكستران المسمى بالفلوريسئين أيزوثيوسيانات (FITC-dextran) لمتابعة نفاذية الأمعاء في الوقت الفعلي عن طريق قياس التألق في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن قياس مستويات FITC-dextran في البلازما والبراز يحدد نفاذية الأمعاء (الشكل 1).
تم استخدام اختبار نفاذية FITC-dextran سابقا في العديد من السياقات المختلفة ، بما في ذلك النماذج الحيوانية لمرض باركنسون7 ، والإنتان8 ، والسكتة الدماغية9 ، وإصابة الحروق10. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام هذا الاختبار مؤخرا للمساعدة في فهم كيفية تورط ميكروبيوم الأمعاء في عمليات المرض المختلفة وكيف يمكن استهدافه أو التلاعب به كعلاج محتمل. على سبيل المثال ، تم استخدامه لدراسة العلاجات القائمة على الميكروبيوم والميكروبيوم في الشيخوخة 11 ، و IBDs12 ، وسرطان القولون والمستقيم 13 ، واضطراب طيف التوحد11. نظرا لأن وظيفة حاجز الأمعاء متورطة في العديد من جوانب الصحة والمرض ، فقد تم استخدام هذا الفحص على نطاق واسع. بساطته النسبية وعبء الوقت المنخفض يجعله مثاليا لاختبار الظروف في الجسم الحي المشتبه في أنها تغير سلامة حاجز الأمعاء. نتائجه الكمية مفيدة لتحديد فعالية العلاج المحتمل.
في هذه الدراسة ، تم تقييم تأثير النظام الغذائي على وظيفة حاجز الأمعاء باستخدام مقايسة FITC-dexman. تمت مقارنة نفاذية الأمعاء للفئران التي تتلقى نظاما غذائيا ضابطا ونفاذية الأمعاء للفئران التي تتلقى نظاما غذائيا مكملا بالأنسولين. Inulin هو قليل السكاريد المفيد الذي ثبت أنه يحسن وظيفة حاجز الأمعاء12,13. بالنسبة لقياسات التألق في الجسم الحي (الخلفية) ، تم استخدام فأر إضافي غير معالج كعنصر تحكم سلبي وتلقى برنامج تلفزيوني بدلا من FITC-dextran. توضح هذه التجربة أن مقايسة FITC-dextran هي أداة قيمة لتقييم نفاذية الأمعاء.
Protocol
Representative Results
Discussion
وظيفة حاجز الأمعاء هي جزء لا يتجزأ من العديد من عمليات المرض المختلفة. وبالتالي ، فإن تقييم نفاذية الأمعاء بطريقة غير جراحية وفعالة من حيث التكلفة وقابلة للقياس الكمي أمر ضروري لتمثيل هذه الأمراض بدقة في النماذج الحيوانية. يوفر اختبار FITC-dextran إمكانية هذا التمثيل. ومع ذلك ، يتضمن هذا البروتوكول العديد من الخطوات الحاسمة التي يجب إكمالها بدقة للحصول على نتائج موثوقة. أولا ، من الضروري ضمان استخدام FITC-dextran ذي الحجم المناسب. لفحص نفاذية الجسم الحي ، 4 كيلو دالتون FITC-dextran هو الوزن الجزيئي الأمثل ، ومع زيادة الوزن الجزيئي ، تنخفض النفاذية15. وبالتالي ، فإن استخدام FITC-dextran بوزن جزيئي مختلف قد يوفر نتائج مربكة أو غير موثوقة. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم ملاحظة وقت كل تجويف وضبط النقاط الزمنية لجمع البيانات في الجسم الحي وجمع البلازما والبراز وفقا لذلك. على سبيل المثال ، إذا تم قطع فأرين بفارق 10 دقائق ، فيجب أن تحدث قراءات مضان في الجسم الحي وجمع البراز والبلازما أيضا على بعد 10 دقائق. تسمح مقارنة التألق في نفس النقاط الزمنية بتمثيل أكثر دقة للاختلافات في النفاذية. علاوة على ذلك ، يجب أن يتناوب الترتيب الذي يتم به اختبار الحيوانات من مجموعات مختلفة لمنع تأثير التجميع بسبب التوقيت. بدلا من اختبار جميع الحيوانات في المجموعة أ أولا ، ثم جميع الحيوانات في المجموعة ب الثانية (AAABBB) ، يوصى بتبديل المجموعة بعد كل (ABABAB).
يمكن تعديل هذا الفحص ليشمل فقط تقييم عينات البلازما والبراز إذا كان هناك نقص في الوصول إلى جهاز التصوير. على الرغم من أن التصوير الفلوري المباشر في الجسم الحي يسمح بتصور المدخول الكبدي ومضان البطن المتبقي ، إلا أن تقييم التألق في عينات البلازما والبراز لا يزال يوفر قياسا كميا لنفاذية الأمعاء. علاوة على ذلك ، كما هو موضح في التجربة الموصوفة ، ترتبط مستويات التألق في البلازما والبراز جيدا بالتصوير في الجسم الحي . بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تعديل هذا الفحص ليشمل التصوير في الجسم الحي فقط. هذا يسمح للحيوانات أن تبقى على قيد الحياة لمواصلة اختبار المعلمات الأخرى أو مراقبة كيفية تغير نفاذية الأمعاء مع مرور الوقت. وبالتالي ، فإن القدرة على تعديل هذا الفحص تجعله متاحا ، ولكنه لا يزال كميا. أخيرا ، تم استخدام جرعة 200 ميكرولتر من 80 مجم · مل −1 FITC-dextran لكل فأر سابقا وثبت أنها فعالة في الفئران ذات الاختلافات الصغيرة في وزن الجسم16. علاوة على ذلك ، من المهم ملاحظة أن جميع الفئران المستخدمة في قسم النتائج التمثيلية تزن حوالي 20 جراما ، مما يسمح باستخدام نفس الجرعة لكل فأر. ومع ذلك ، لحساب الاختلافات في وزن الجسم ، يمكن إعطاء FITC-dextran بجرعة 0.6-0.8 مجم / جم من وزن الجسم ، على سبيل المثال17. بشكل حاسم ، بغض النظر عن الجرعة المستخدمة ، من المهم الحد من الكمية التي يتم التخلص منها لكل فأر إلى أقل من 10 مل · كجم − 1 لمنع المضاعفات أو الانزعاج18.
على الرغم من أن اختبار FITC-dextran يوفر طريقة فعالة لتقييم وظيفة حاجز الأمعاء ، إلا أنه لا يزال لديه بعض القيود. أحد قيود هذا النموذج هو أنه يتطلب صيام الفئران لعدة ساعات ، مما يعني أنه لا يمكن الاعتماد على مقارنة هذه النتائج بتلك الموجودة في الفئران التي لم يتم صيامها. بالإضافة إلى ذلك ، قد يؤثر الصيام على النتائج في بعض النماذج التي تتطلب جداول تغذية صارمة ، مثل عند قياس نسبة الجلوكوز في الدم في النماذج الحيوانية لمرض السكري.
على الرغم من هذه القيود ، يظل اختبار FITC-dextran طريقة فعالة لتحليل نفاذية الأمعاء لأنها كمية ومتعددة الاستخدامات وفعالة من حيث التكلفة وأقل توغلا من العديد من الطرق الكلاسيكية. على سبيل المثال ، المجسات الشائعة المستخدمة لقياس نفاذية الأمعاء هي مجسات السكاريد الصغيرة أو Cr-EDTA ، والتي لها بعض المزايا19. ومع ذلك ، فإن بعض مجسات السكاريد لها نفاذية خاصة بالمنطقة فقط. نظرا لأنها تتحلل مائيا في الجزء البعيد من الأمعاء الدقيقة ، فإنها لا تقدم نظرة ثاقبة لنفاذية القولون19. من ناحية أخرى ، يمكن أن يوفر Cr-EDTA معلومات حول نفاذية القولون ولكنه يتطلب قياسات لمدة 24 ساعة ، مما يجعل العبء الزمني لهذه الطريقة أعلى بكثير من اختبار FITC-dextran20. علاوة على ذلك ، لا توفر أي من هذه الطرق التصوير المباشر في الجسم الحي لهذا الفحص. لذلك ، يوفر اختبار FITC-dextran خيارا بسيطا ومباشرا وفعالا نسبيا مقارنة بالطرق البديلة لقياس نفاذية الأمعاء.
أخيرا ، في عمليات المرض مثل IBDs4 ومرض الزهايمر21 وأمراض الكبد2 ، تعد نفاذية الأمعاء معلمة مهمة يمكن قياسها باستخدام مقايسة FITC-dextran لتحسين الدراسات. على سبيل المثال ، عند تطوير علاجات جديدة ، مثل العلاجات المناعية لمرض التهاب الأمعاء ، يمكن استخدام هذا الاختبار لاختبار فعالية العلاج للحفاظ على سلامة حاجز الأمعاء. بالنظر إلى أن ضعف وظيفة حاجز الأمعاء قد يكون متورطا في إدامة الالتهاب المزمن في جامعة كاليفورنيا ، على سبيل المثال ، من المهم فحص مدى جودة الحماية العلاجية من زيادة النفاذية4. هذا مثال واحد فقط ، لكن اختبار FITC-dextran هو طريقة يمكن الوصول إليها وقابلة للقياس الكمي لقياس نفاذية الأمعاء في العديد من مجالات وجوانب البحث المختلفة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل بمنحة من مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (منحة RGPIN-2018-06442 إلى MMS). نشكر مرفق الحيوانات في CRCHUM والدكتور Junzheng Peng من منصة التنميط الظاهري للقلب والأوعية الدموية.
Materials
| 50 ppm Fe Diet (10% Inulin) | Envigo Teklad | TD.190651 | Representative Results |
| 50 ppm Fe Diet (FeSO4) | Envigo Teklad | TD.190723 | Representative Results |
| BALB/c Mice 49-55 Days, Female | Charles River | 028BALB/C | Representative Results |
| BD 1 mL Syringe Tuberculin Slip Tip | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For gavage |
| BD Microtainer Tubes – With LH (Lithium Heparin) | Becton, Dickinson and Company | 365965 | For plasma collection |
| Centrifuge 5420 | Eppendorf | S420KN605698 | |
| Curved Gavage Needle (Gavage Cannula) 7.7.0 38 mm x 22 G | Harvard Apparatus Canada | 34-024 | No longer available – A potential alternative is available at Instech Labs (FTP-22-38) |
| Euthanyl (Pentobarbital Sodium) 240 mg/mL | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 141704 | 1/100 dilution; Administered via intraperitoneal injection at 0.03 mL/g body weight |
| FITC-dextran 4 | TdB Labs | 20550 | |
| Heparinized Capillary Tubes | Kimble Chase Life Science and Research | 2501 | For retro-orbital blood collection |
| Microplate, PS, 96-well, Flat-bottom (Chimney Well), Black, Flutrac, Med. Binding | Greiner Bio-one | 655076 | |
| MiniARCO Clipper Kit | Kent Scientific | CL8787-KIT | For hair removal |
| Optix MX2 and Optix Optiview | Advanced Research Technologies | 2.02.00.6 | Fluorescence imaging machine and software |
| Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Wisent Inc | 311-010-LL | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | 12920060 | Ophthalmic ointement to prevent eye damage during anesthesia |
| Spark Multiplate Reader | Tecan | 30086376 |
References
- König, J., et al. Human intestinal barrier function in health and disease. Clinical and Translational Gastroenterology. 7 (10), 196 (2016).
- Lorenzo-Zuniga, V., et al. Insulin-like growth factor I improves intestinal barrier function in cirrhotic rats. Gut. 55 (9), 1306-1312 (2006).
- Schwarz, B. T., et al. LIGHT signals directly to intestinal epithelia to cause barrier dysfunction via cytoskeletal and endocytic mechanisms. Gastroenterology. 132 (7), 2383-2394 (2007).
- Schmitz, H., et al. Altered tight junction structure contributes to the impaired epithelial barrier function in ulcerative colitis. Gastroenterology. 116 (2), 301-309 (1999).
- Fouts, D. E., Torralba, M., Nelson, K. E., Brenner, D. A., Schnabl, B. Bacterial translocation and changes in the intestinal microbiome in mouse models of liver disease. Journal of Hepatology. 56 (6), 1283-1292 (2012).
- Galipeau, H. J., Verdu, E. F. The complex task of measuring intestinal permeability in basic and clinical science. Neurogastroenterology and Motility. 28 (7), 957-965 (2016).
- Bordoni, L., et al. Positive effect of an electrolyzed reduced water on gut permeability, fecal microbiota and liver in an animal model of Parkinson’s disease. PLoS One. 14 (10), 0223238 (2019).
- Wang, Q., Fang, C. H., Hasselgren, P. -. O. Intestinal permeability is reduced and IL-10 levels are increased in septic IL-6 knockout mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 281 (3), 1013-1023 (2001).
- Crapser, J., et al. Ischemic stroke induces gut permeability and enhances bacterial translocation leading to sepsis in aged mice. Aging. 8 (5), 1049-1063 (2016).
- Mal Earley, Z., et al. Burn injury alters the intestinal microbiome and increases gut permeability and bacterial translocation. PLoS One. 10 (7), 0129996 (2015).
- Sharon, G., et al. Human gut microbiota from autism spectrum disorder promote behavioral symptoms in mice. Cell. 177 (6), 1600-1618 (2019).
- Schroeder, B. O., et al. Bifidobacteria or fiber protects against diet-induced microbiota-mediated colonic mucus deterioration. Cell Host & Microbe. 23 (1), 27-40 (2018).
- Hajjar, R., et al. Improvement of colonic healing and surgical recovery with perioperative supplementation of inulin and galacto-oligosaccharides. Clinical Nutrition. 40 (6), 3842-3851 (2021).
- JoVE. Lab Animal Research. Blood Withdrawal I. JoVE Science Education Database. , (2022).
- Costantini, T. W., et al. Quantitative assessment of intestinal injury using a novel in vivo, near-infrared imaging technique. Molecular Imaging. 9 (1), 30-39 (2010).
- Thevaranjan, N., et al. Age-associated microbial dysbiosis promotes intestinal permeability, systemic inflammation, and macrophage dysfunction. Cell Host & Microbe. 21 (4), 455-466 (2017).
- Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. Current Protocols in Immunology. 104, 1-14 (2014).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
- Arrieta, M. C., Bistritz, L., Meddings, J. B. Alterations in intestinal permeability. Gut. 55 (10), 1512-1520 (2006).
- von Martels, J. Z. H., Bourgonje, A. R., Harmsen, H. J. M., Faber, K. N., Dijkstra, G. Assessing intestinal permeability in Crohn’s disease patients using orally administered 52Cr-EDTA. PLoS One. 14 (2), 0211973 (2019).
- Gonzalez-Escamilla, G., Atienza, M., Garcia-Solis, D., Cantero, J. L. Cerebral and blood correlates of reduced functional connectivity in mild cognitive impairment. Brain Structure and Function. 221 (1), 631-645 (2016).
