Nel presente studio, il destrano marcato con fluoresceina-isotiocianato (FITC) viene somministrato ai topi tramite sonda gastrica orale per valutare la permeabilità intestinale sia in vivo che in campioni plasmatici e fecali. Poiché la funzione di barriera intestinale è influenzata in molti processi patologici, questo test diretto e quantitativo può essere utilizzato in diverse aree di ricerca.
L’integrità della barriera intestinale è un segno distintivo della salute intestinale. Mentre l’integrità della barriera intestinale può essere valutata utilizzando marcatori indiretti come la misurazione dei marcatori infiammatori plasmatici e la traslocazione batterica alla milza e ai linfonodi, il gold standard quantifica direttamente la capacità di molecole selezionate di attraversare lo strato mucoso intestinale verso la circolazione sistemica. Questo articolo utilizza una tecnica non invasiva, economica e a basso carico per quantificare e seguire in tempo reale la permeabilità intestinale nei topi utilizzando destrano marcato con fluoresceina-isotiocianato (FITC-destrano). Prima dell’integrazione orale con FITC-destrano, i topi vengono digiunati. Vengono quindi gavagati con destrano FITC diluito in soluzione salina tamponata fosfato (PBS). Un’ora dopo il gavage, i topi vengono sottoposti ad anestesia generale utilizzando isoflurano e la fluorescenza in vivo viene visualizzata in una camera di imaging. Questa tecnica mira a valutare la fluorescenza residua nella cavità addominale e l’assorbimento epatico, che è suggestivo della migrazione portale della sonda fluorescente. I campioni di sangue e feci vengono raccolti 4 ore dopo il gavage orale e i topi vengono sacrificati. I campioni di plasma e feci diluiti in PBS vengono quindi placcati e la fluorescenza viene registrata. La concentrazione di FITC-destrano viene quindi calcolata utilizzando una curva standard. In ricerche precedenti, l’imaging in vivo ha dimostrato che la fluorescenza si diffonde rapidamente al fegato nei topi con una barriera intestinale più debole indotta da una dieta povera di fibre, mentre nei topi integrati con fibre per rafforzare la barriera intestinale, il segnale fluorescente viene mantenuto principalmente nel tratto gastrointestinale. Inoltre, in questo studio, i topi di controllo avevano un’elevata fluorescenza plasmatica e una ridotta fluorescenza nelle feci, mentre inversamente, i topi integrati con inulina avevano livelli più elevati di segnali di fluorescenza nell’intestino e bassi livelli nel plasma. In sintesi, questo protocollo fornisce misurazioni qualitative e quantitative della permeabilità intestinale come marker per la salute dell’intestino.
La barriera intestinale svolge un ruolo importante sia nella salute che nella malattia. Richiede un complesso equilibrio tra consentire ai nutrienti necessari di permeare nella circolazione dal lume intestinale e contemporaneamente impedire la penetrazione di molecole pro-infiammatorie, come agenti patogeni o antigeni1. L’aumento della permeabilità può essere causato da molti disturbi gastrointestinali, come malattie del fegato o malattie infiammatorie intestinali (IBD)2,3. Ad esempio, nella colite ulcerosa (UC), una IBD, l’infiammazione cronica porta alla rottura delle giunzioni strette, alla successiva rottura della barriera intestinale e alla traslocazione dei batteri, potenzialmente perpetuando l’infiammazione mucosa e sistemica4.
L’integrità della barriera intestinale è, quindi, un importante indicatore della salute dell’intestino. Tuttavia, i metodi attuali per la misurazione della permeabilità intestinale hanno molte limitazioni. Ad esempio, i metodi che misurano i marcatori infiammatori plasmatici o la traslocazione batterica alla milza e ai linfonodi sono indiretti 5,6. Altri metodi possono essere invasivi e richiedere molto tempo. Questo articolo descrive un test non invasivo ed economico che misura direttamente e quantitativamente la permeabilità intestinale. Questo test utilizza destrano marcato con fluoresceina-isotiocianato (FITC-destrano) per seguire la permeabilità intestinale in tempo reale misurando la fluorescenza in vivo. Inoltre, la misurazione dei livelli di destrano FITC nel plasma e nelle feci quantifica la permeabilità intestinale (Figura 1).
Il test di permeabilità FITC-destrano è stato utilizzato in precedenza in molti contesti diversi, inclusi modelli animali di malattia di Parkinson7, sepsi8, ictus ischemico9 e lesioni da ustione10. Inoltre, questo test è stato utilizzato di recente per aiutare a capire come il microbioma intestinale può essere implicato in diversi processi patologici e come può essere mirato o manipolato come potenziale terapeutico. Ad esempio, è stato utilizzato per studiare il microbioma e le terapie basate sul microbioma nell’età di 11, IBD 12, cancro del colon-retto13 e disturbo dello spettro autistico11. Poiché la funzione della barriera intestinale è implicata in numerosi aspetti della salute e della malattia, questo test è stato ampiamente utilizzato. La sua relativa semplicità e il basso carico di tempo lo rendono ideale per testare le condizioni in vivo sospettate di alterare l’integrità della barriera intestinale. I suoi risultati quantitativi sono utili per determinare l’efficacia di un potenziale trattamento.
In questo studio, l’effetto della dieta sulla funzione della barriera intestinale è stato valutato utilizzando il test FITC-destrano. Sono state confrontate la permeabilità intestinale dei topi che ricevono una dieta di controllo e la permeabilità intestinale dei topi che ricevono una dieta integrata con inulina. L’inulina è un oligosaccaride benefico che ha dimostrato di migliorare la funzione della barriera intestinale12,13. Per le misurazioni di fluorescenza in vivo (background), un altro topo non trattato è stato utilizzato come controllo negativo e ha ricevuto PBS invece di FITC-destrano. Questo esperimento dimostra che il test FITC-destrano è uno strumento prezioso per valutare la permeabilità intestinale.
La funzione di barriera intestinale è parte integrante di molti processi patologici diversi. Pertanto, valutare la permeabilità intestinale in modo non invasivo, economico e quantificabile è essenziale per rappresentare accuratamente queste malattie in modelli animali. Il saggio FITC-dextran offre la possibilità di questa rappresentazione. Tuttavia, questo protocollo comporta diversi passaggi critici che devono essere completati con precisione per ottenere risultati affidabili. In primo luogo, è essenziale garantire l’uso di un destrano FITC di dimensioni adeguate. Per esaminare la permeabilità in vivo , 4 kDa FITC-destrano è il peso molecolare ottimale e, all’aumentare del peso molecolare, la permeabilità diminuiscedi 15. Pertanto, l’uso di FITC-destrano di un peso molecolare diverso può fornire risultati confusi o inaffidabili. Inoltre, è importante annotare il tempo di ciascun gavage e regolare di conseguenza i punti temporali per la raccolta di dati in vivo e la raccolta di plasma e feci. Ad esempio, se due topi vengono gavagati a 10 minuti di distanza, anche le letture di fluorescenza in vivo e la raccolta di feci e plasma devono avvenire a 10 minuti di distanza. Il confronto della fluorescenza negli stessi punti temporali consente una rappresentazione più accurata delle differenze di permeabilità. Inoltre, l’ordine in cui gli animali di gruppi diversi sono sottoposti a test dovrebbe essere alternato per evitare un effetto di raggruppamento dovuto alla tempistica. Invece di testare prima tutti gli animali del gruppo A, poi tutti gli animali del secondo gruppo B (AAABBB), si raccomanda di cambiare gruppo dopo ogni animale (ABABAB).
Questo test può essere modificato per includere solo la valutazione di campioni di plasma e fecali se vi è una mancanza di accesso a una macchina di imaging. Sebbene l’imaging a fluorescenza diretta in vivo consenta la visualizzazione dell’assunzione epatica e della fluorescenza addominale residua, la valutazione della fluorescenza nei campioni plasmatici e fecali fornisce comunque una misurazione quantitativa della permeabilità intestinale. Inoltre, come dimostrato dall’esperimento descritto, i livelli di fluorescenza nel plasma e nelle feci si correlano bene con l’imaging in vivo . Inoltre, questo test può essere modificato per includere solo l’imaging in vivo . Ciò consente agli animali di essere mantenuti in vita per continuare a testare altri parametri o monitorare come cambia la permeabilità intestinale nel tempo. La possibilità di modificare questo test, quindi, lo rende accessibile, ma ancora quantitativo. Infine, il dosaggio di 200 μL di 80 mg·mL−1 FITC-destrano somministrato a ciascun topo è stato utilizzato in precedenza e si è dimostrato efficace nei topi con piccole differenze nel peso corporeo16. Inoltre, è importante notare che tutti i topi utilizzati nella sezione dei risultati rappresentativi pesavano circa 20 g, consentendo di utilizzare lo stesso dosaggio per ciascun topo. Per tenere conto delle differenze di peso corporeo, tuttavia, il FITC-destrano può essere somministrato alla dose di 0,6-0,8 mg/g di peso corporeo, ad esempio17. Fondamentalmente, indipendentemente dal dosaggio utilizzato, è importante limitare la quantità di gavag a ciascun topo a meno di 10 mL·kg−1 per prevenire complicazioni o disagi18.
Sebbene il test FITC-destrano fornisca un metodo efficace per valutare la funzione della barriera intestinale, ha ancora alcune limitazioni. Una limitazione di questo modello è che richiede il digiuno dei topi per diverse ore, il che significa che non è affidabile confrontare questi risultati con quelli dei topi che non sono stati digiunati. Inoltre, il digiuno può influenzare i risultati in alcuni modelli che richiedono programmi di alimentazione rigorosi, come quando si misura la glicemia in modelli animali per il diabete.
Nonostante queste limitazioni, il test FITC-destrano rimane un metodo efficace per analizzare la permeabilità intestinale in quanto è quantitativo, versatile, economico e meno invasivo di molti metodi classici. Ad esempio, le sonde comuni utilizzate per misurare la permeabilità intestinale sono piccole sonde saccaridiche o Cr-EDTA, che presentano alcuni vantaggi19. Tuttavia, alcune sonde saccaridiche hanno solo permeabilità specifica della regione. Poiché sono idrolizzati nella porzione distale dell’intestino tenue, non forniscono alcuna informazione sulla permeabilità del colon19. D’altra parte, Cr-EDTA può fornire informazioni sulla permeabilità del colon, ma richiede misurazioni per 24 ore, rendendo il carico di tempo di questo metodo molto più elevato di quello del saggio FITC-destrano20. Inoltre, nessuno di questi metodi fornisce l’imaging diretto in vivo di questo test. Pertanto, il test FITC-destrano fornisce un’opzione relativamente semplice, diretta ed efficace rispetto ai metodi alternativi per misurare la permeabilità intestinale.
Infine, nei processi patologici come IBD4, Alzheimer21 e malattia epatica2, la permeabilità intestinale è un parametro importante che potrebbe essere misurato utilizzando il test FITC-destrano per migliorare gli studi. Ad esempio, nello sviluppo di nuovi trattamenti, come le immunoterapie per le IBD, questo test può essere utilizzato per testare l’efficacia della terapia per mantenere l’integrità della barriera intestinale. Considerando che la compromissione della funzione della barriera intestinale può essere implicata nel perpetuare l’infiammazione cronica nella UC, ad esempio,è importante esaminare quanto bene una terapia protegga dall’aumento della permeabilità 4. Questo è solo un esempio, ma il test FITC-destrano è un modo accessibile e quantificabile per misurare la permeabilità intestinale in molte aree e aspetti diversi della ricerca.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (sovvenzione RGPIN-2018-06442 a MMS). Ringraziamo la struttura per animali presso il CRCHUM e il Dr. Junzheng Peng della Cardiovascular Phenotyping Platform.
50 ppm Fe Diet (10% Inulin) | Envigo Teklad | TD.190651 | Representative Results |
50 ppm Fe Diet (FeSO4) | Envigo Teklad | TD.190723 | Representative Results |
BALB/c Mice 49-55 Days, Female | Charles River | 028BALB/C | Representative Results |
BD 1 mL Syringe Tuberculin Slip Tip | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For gavage |
BD Microtainer Tubes – With LH (Lithium Heparin) | Becton, Dickinson and Company | 365965 | For plasma collection |
Centrifuge 5420 | Eppendorf | S420KN605698 | |
Curved Gavage Needle (Gavage Cannula) 7.7.0 38 mm x 22 G | Harvard Apparatus Canada | 34-024 | No longer available – A potential alternative is available at Instech Labs (FTP-22-38) |
Euthanyl (Pentobarbital Sodium) 240 mg/mL | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 141704 | 1/100 dilution; Administered via intraperitoneal injection at 0.03 mL/g body weight |
FITC-dextran 4 | TdB Labs | 20550 | |
Heparinized Capillary Tubes | Kimble Chase Life Science and Research | 2501 | For retro-orbital blood collection |
Microplate, PS, 96-well, Flat-bottom (Chimney Well), Black, Flutrac, Med. Binding | Greiner Bio-one | 655076 | |
MiniARCO Clipper Kit | Kent Scientific | CL8787-KIT | For hair removal |
Optix MX2 and Optix Optiview | Advanced Research Technologies | 2.02.00.6 | Fluorescence imaging machine and software |
Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Wisent Inc | 311-010-LL | |
Puralube Vet Ointment | Dechra | 12920060 | Ophthalmic ointement to prevent eye damage during anesthesia |
Spark Multiplate Reader | Tecan | 30086376 |