En el presente estudio, el dextrano marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) se administra a ratones a través de sonda oral para evaluar la permeabilidad intestinal tanto in vivo como en muestras plasmáticas y fecales. Como la función de barrera intestinal se ve afectada en muchos procesos de enfermedad, este ensayo directo y cuantitativo se puede utilizar en diversas áreas de investigación.
La integridad de la barrera intestinal es un sello distintivo de la salud intestinal. Si bien la integridad de la barrera intestinal se puede evaluar utilizando marcadores indirectos como la medición de marcadores inflamatorios plasmáticos y la translocación bacteriana al bazo y los ganglios linfáticos, el estándar de oro cuantifica directamente la capacidad de las moléculas seleccionadas para atravesar la capa mucosa intestinal hacia la circulación sistémica. Este artículo utiliza una técnica no invasiva, rentable y de baja carga para cuantificar y seguir en tiempo real la permeabilidad intestinal en ratones utilizando dextrano marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC-dextrano). Antes de la suplementación oral con FITC-dextrano, los ratones están en ayunas. Luego se gavagan con FITC-dextrano diluido en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Una hora después del sonda nasogástrica, los ratones son sometidos a anestesia general usando isoflurano, y la fluorescencia in vivo se visualiza en una cámara de imágenes. Esta técnica tiene como objetivo evaluar la fluorescencia residual en la cavidad abdominal y la captación hepática, lo que sugiere la migración portal de la sonda fluorescente. Las muestras de sangre y heces se recogen 4 h después de la sonda nasogástrica oral, y los ratones son sacrificados. Las muestras plasmáticas y fecales diluidas en PBS se platean y se registra la fluorescencia. La concentración de FITC-dextrano se calcula utilizando una curva estándar. En investigaciones anteriores, las imágenes in vivo han demostrado que la fluorescencia se propaga rápidamente al hígado en ratones con una barrera intestinal más débil inducida por una dieta baja en fibra, mientras que en ratones suplementados con fibra para fortalecer la barrera intestinal, la señal fluorescente se retiene principalmente en el tracto gastrointestinal. Además, en este estudio, los ratones de control tenían fluorescencia plasmática elevada y fluorescencia reducida en las heces, mientras que inversamente, los ratones suplementados con inulina tenían niveles más altos de señales de fluorescencia en el intestino y niveles bajos en el plasma. En resumen, este protocolo proporciona mediciones cualitativas y cuantitativas de la permeabilidad intestinal como marcador de la salud intestinal.
La barrera intestinal juega un papel importante tanto en la salud como en la enfermedad. Requiere un equilibrio complejo entre permitir que los nutrientes requeridos penetren en la circulación desde la luz intestinal y, al mismo tiempo, prevenir la penetración de moléculas proinflamatorias, como patógenos o antígenos1. El aumento de la permeabilidad puede ser causado por muchos trastornos gastrointestinales, como la enfermedad hepática o las enfermedades inflamatorias intestinales (EII)2,3. Por ejemplo, en la colitis ulcerosa (CU), una EII, la inflamación crónica conduce a la ruptura de las uniones estrechas, la posterior interrupción de la barrera intestinal y la translocación de bacterias, perpetuando potencialmente la inflamación mucosa y sistémica4.
La integridad de la barrera intestinal es, por lo tanto, un marcador importante de la salud intestinal. Sin embargo, los métodos actuales para la medición de la permeabilidad intestinal tienen muchas limitaciones. Por ejemplo, los métodos que miden los marcadores inflamatorios plasmáticos o la translocación bacteriana al bazo y los ganglios linfáticos son indirectos 5,6. Otros métodos pueden ser invasivos y requieren mucho tiempo. Este artículo describe un ensayo no invasivo y rentable que mide directa y cuantitativamente la permeabilidad intestinal. Este ensayo utiliza dextrano marcado con fluoresceína-isotiocianato (FITC-dextrano) para seguir la permeabilidad intestinal en tiempo real mediante la medición de la fluorescencia in vivo. Además, la medición de los niveles de FITC-dextrano en el plasma y las heces cuantifica la permeabilidad intestinal (Figura 1).
El ensayo de permeabilidad FITC-dextrano se ha utilizado anteriormente en muchos contextos diferentes, incluso en modelos animales de enfermedad de Parkinson7, sepsis8, accidente cerebrovascular isquémico9 y lesión por quemadura10. Además, este ensayo se ha utilizado recientemente para ayudar a comprender cómo el microbioma intestinal puede estar implicado en diferentes procesos de enfermedad y cómo puede ser dirigido o manipulado como una posible terapéutica. Por ejemplo, se ha utilizado para estudiar el microbioma y la terapéutica basada en el microbioma en el envejecimiento 11, las EII12, el cáncer colorrectal13 y el trastorno del espectro autista11. Como la función de barrera intestinal está implicada en numerosos aspectos de la salud y la enfermedad, este ensayo se ha utilizado ampliamente. Su relativa simplicidad y baja carga de tiempo lo hacen ideal para probar las condiciones in vivo que se sospecha que alteran la integridad de la barrera intestinal. Sus resultados cuantitativos son útiles para determinar la efectividad de un tratamiento potencial.
En este estudio, el efecto de la dieta sobre la función de barrera intestinal se evaluó mediante el ensayo FITC-dextrano. Se compararon la permeabilidad intestinal de los ratones que recibieron una dieta de control y la permeabilidad intestinal de los ratones que recibieron una dieta suplementada con inulina. La inulina es un oligosacárido beneficioso que ha demostrado mejorar la función de barrera intestinal12,13. Para las mediciones de fluorescencia in vivo (fondo), se utilizó un ratón adicional no tratado como control negativo y recibió PBS en lugar de FITC-dextrano. Este experimento demuestra que el ensayo FITC-dextrano es una herramienta valiosa para evaluar la permeabilidad intestinal.
La función de barrera intestinal es una parte integral de muchos procesos de enfermedades diferentes. Por lo tanto, evaluar la permeabilidad intestinal de una manera no invasiva, rentable y cuantificable es esencial para representar con precisión estas enfermedades en modelos animales. El ensayo FITC-dextrano ofrece la posibilidad de esta representación. Sin embargo, este protocolo implica varios pasos críticos que deben completarse con precisión para obtener resultados confiables. En primer lugar, es esencial garantizar el uso de FITC-dextrano del tamaño adecuado. Para examinar la permeabilidad in vivo , 4 kDa FITC-dextrano es el peso molecular óptimo, y a medida que aumenta el peso molecular, la permeabilidad disminuye15. Por lo tanto, el uso de FITC-dextrano de un peso molecular diferente puede proporcionar resultados confusos o poco fiables. Además, es importante anotar el tiempo de cada sonda nasogástrica y ajustar los puntos de tiempo para la recopilación de datos in vivo y la recolección de plasma y heces en consecuencia. Por ejemplo, si dos ratones están separados por 10 minutos, las lecturas de fluorescencia in vivo y la recolección de heces y plasma también deben ocurrir con 10 minutos de diferencia. La comparación de la fluorescencia en los mismos puntos de tiempo permite una representación más precisa de las diferencias en la permeabilidad. Además, el orden en que se someten a ensayo los animales de diferentes grupos debe alternarse para evitar un efecto de agrupación debido al tiempo. En lugar de probar primero a todos los animales del Grupo A, luego a todos los animales del Grupo B en segundo lugar (AAABBB), se recomienda cambiar el grupo después de cada animal (ABABAB).
Este ensayo puede modificarse para incluir solo la evaluación de muestras plasmáticas y fecales si no hay acceso a una máquina de imágenes. Aunque la fluorescencia directa in vivo permite la visualización de la ingesta hepática y la fluorescencia abdominal residual, la evaluación de la fluorescencia en las muestras plasmáticas y fecales todavía proporciona una medición cuantitativa de la permeabilidad intestinal. Además, como lo demuestra el experimento descrito, los niveles de fluorescencia en el plasma y las heces se correlacionan bien con las imágenes in vivo . Además, este ensayo se puede modificar para incluir solo las imágenes in vivo . Esto permite que los animales se mantengan vivos para continuar probando otros parámetros o monitorear cómo cambia la permeabilidad intestinal con el tiempo. La capacidad de modificar este ensayo, por lo tanto, lo hace accesible, pero aún cuantitativo. Finalmente, la dosis de 200 μL de 80 mg·mL−1 de FITC-dextrano administrada a cada ratón ha sido utilizada previamente y ha demostrado ser efectiva en ratones con pequeñas diferencias en el peso corporal16. Además, es importante tener en cuenta que todos los ratones utilizados en la sección de resultados representativos pesaban aproximadamente 20 g, lo que permite utilizar la misma dosis para cada ratón. Sin embargo, para tener en cuenta las diferencias en el peso corporal, FITC-dextrano puede administrarse a una dosis de 0,6-0,8 mg / g de peso corporal, por ejemplo17. Fundamentalmente, independientemente de la dosis utilizada, es importante limitar la cantidad administrada a cada ratón a menos de 10 mL·kg−1 para prevenir complicaciones o molestias18.
Aunque el ensayo FITC-dextrano proporciona un método eficaz para evaluar la función de barrera intestinal, todavía tiene algunas limitaciones. Una limitación de este modelo es que requiere ayunar a los ratones durante varias horas, lo que significa que no es confiable comparar estos resultados con los de ratones que no han sido ayunados. Además, el ayuno puede afectar los resultados en ciertos modelos que requieren horarios de alimentación estrictos, como cuando se mide la glucosa en sangre en modelos animales para la diabetes.
A pesar de estas limitaciones, el ensayo FITC-dextrano sigue siendo un método eficaz para analizar la permeabilidad intestinal, ya que es cuantitativo, versátil, rentable y menos invasivo que muchos métodos clásicos. Por ejemplo, las sondas comunes utilizadas para medir la permeabilidad intestinal son las pequeñas sondas de sacáridos o Cr-EDTA, que tienen algunas ventajas19. Sin embargo, algunas sondas de sacáridos solo tienen permeabilidad específica de la región. Como se hidrolizan en la porción distal del intestino delgado, no proporcionan información sobre la permeabilidad colónica19. Por otro lado, Cr-EDTA puede proporcionar información sobre la permeabilidad colónica, pero requiere mediciones durante 24 h, lo que hace que la carga de tiempo de este método sea mucho mayor que la del ensayo FITC-dextrano20. Además, ninguno de estos métodos proporciona la imagen directa in vivo de este ensayo. Por lo tanto, el ensayo FITC-dextrano proporciona una opción relativamente simple, directa y efectiva en comparación con los métodos alternativos para medir la permeabilidad intestinal.
Finalmente, en procesos de enfermedades como la EII4, la enfermedad de Alzheimer21 y la enfermedad hepática2, la permeabilidad intestinal es un parámetro importante que podría medirse utilizando el ensayo FITC-dextrano para mejorar los estudios. Por ejemplo, en el desarrollo de nuevos tratamientos, como las inmunoterapias para las EII, este ensayo se puede utilizar para probar la eficacia de la terapia para mantener la integridad de la barrera intestinal. Teniendo en cuenta que la función de barrera intestinal deteriorada puede estar implicada en la perpetuación de la inflamación crónica en la CU, por ejemplo, examinar qué tan bien una terapia protege contra el aumento de la permeabilidades importante 4. Este es solo un ejemplo, pero el ensayo FITC-dextrano es una forma accesible y cuantificable de medir la permeabilidad intestinal en muchas áreas y aspectos diferentes de la investigación.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por una subvención del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (subvención RGPIN-2018-06442 a MMS). Agradecemos a la instalación de animales en el CRCHUM y al Dr. Junzheng Peng de la Plataforma de Fenotipado Cardiovascular.
50 ppm Fe Diet (10% Inulin) | Envigo Teklad | TD.190651 | Representative Results |
50 ppm Fe Diet (FeSO4) | Envigo Teklad | TD.190723 | Representative Results |
BALB/c Mice 49-55 Days, Female | Charles River | 028BALB/C | Representative Results |
BD 1 mL Syringe Tuberculin Slip Tip | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For gavage |
BD Microtainer Tubes – With LH (Lithium Heparin) | Becton, Dickinson and Company | 365965 | For plasma collection |
Centrifuge 5420 | Eppendorf | S420KN605698 | |
Curved Gavage Needle (Gavage Cannula) 7.7.0 38 mm x 22 G | Harvard Apparatus Canada | 34-024 | No longer available – A potential alternative is available at Instech Labs (FTP-22-38) |
Euthanyl (Pentobarbital Sodium) 240 mg/mL | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 141704 | 1/100 dilution; Administered via intraperitoneal injection at 0.03 mL/g body weight |
FITC-dextran 4 | TdB Labs | 20550 | |
Heparinized Capillary Tubes | Kimble Chase Life Science and Research | 2501 | For retro-orbital blood collection |
Microplate, PS, 96-well, Flat-bottom (Chimney Well), Black, Flutrac, Med. Binding | Greiner Bio-one | 655076 | |
MiniARCO Clipper Kit | Kent Scientific | CL8787-KIT | For hair removal |
Optix MX2 and Optix Optiview | Advanced Research Technologies | 2.02.00.6 | Fluorescence imaging machine and software |
Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Wisent Inc | 311-010-LL | |
Puralube Vet Ointment | Dechra | 12920060 | Ophthalmic ointement to prevent eye damage during anesthesia |
Spark Multiplate Reader | Tecan | 30086376 |