В настоящем исследовании меченый флуоресцеин-изотиоцианатом декстран вводят мышам через ротовой зонд для оценки проницаемости кишечника как in vivo, так и в образцах плазмы и фекалий. Поскольку барьерная функция кишечника затрагивается во многих болезненных процессах, этот прямой и количественный анализ может быть использован в различных областях исследований.
Целостность кишечного барьера является отличительной чертой здоровья кишечника. В то время как целостность кишечного барьера может быть оценена с помощью косвенных маркеров, таких как измерение маркеров воспаления плазмы и бактериальной транслокации в селезенку и лимфатические узлы, золотой стандарт напрямую количественно оценивает способность выбранных молекул пересекать слой слизистой оболочки кишечника к системному кровообращению. В этой статье используется неинвазивный, экономически эффективный и малонагрузочный метод для количественной оценки и отслеживания в режиме реального времени проницаемости кишечника у мышей с использованием меченного флуоресцеин-изотиоцианатом декстрана (FITC-декстран). Перед пероральным приемом добавок с FITC-декстраном мышей проводят натощак. Затем их продувают FITC-декстраном, разбавленным фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS). Через час после зонда мышей подвергают общей анестезии с использованием изофлурана, а флуоресценция in vivo визуализируется в камере визуализации. Этот метод направлен на оценку остаточной флуоресценции в брюшной полости и печеночного поглощения, что указывает на портальную миграцию флуоресцентного зонда. Образцы крови и стула собирают через 4 часа после перорального зонда, и мышей приносят в жертву. Затем образцы плазмы и фекалий, разбавленные в PBS, покрываются и регистрируется флуоресценция. Затем концентрация декстрана FITC рассчитывается с использованием стандартной кривой. В предыдущих исследованиях визуализация in vivo показала, что флуоресценция быстро распространяется на печень у мышей с более слабым кишечным барьером, вызванным диетой с низким содержанием клетчатки, в то время как у мышей, получавших клетчатку для укрепления кишечного барьера, флуоресцентный сигнал сохраняется в основном в желудочно-кишечном тракте. Кроме того, в этом исследовании у контрольных мышей наблюдалась повышенная флуоресценция плазмы и сниженная флуоресценция в стуле, в то время как у мышей, получавших инулин, были более высокие уровни сигналов флуоресценции в кишечнике и низкие уровни в плазме. Таким образом, этот протокол обеспечивает качественные и количественные измерения проницаемости кишечника в качестве маркера здоровья кишечника.
Кишечный барьер играет важную роль как в здоровье, так и в болезнях. Это требует сложного баланса между тем, чтобы позволить необходимым питательным веществам проникать в кровоток из просвета кишечника и одновременно предотвращать проникновение провоспалительных молекул, таких как патогены или антигены1. Повышенная проницаемость может быть вызвана многими желудочно-кишечными расстройствами, такими как заболевания печени или воспалительные заболевания кишечника (ВЗК)2,3. Например, при язвенном колите (ЯК), ВЗК, хроническое воспаление приводит к разрушению плотных соединений, последующему нарушению кишечного барьера и транслокации бактерий, потенциально увековечивая воспаление слизистой оболочки и системное воспаление4.
Таким образом, целостность кишечного барьера является важным маркером здоровья кишечника. Однако современные методы измерения проницаемости кишечника имеют много ограничений. Например, методы измерения маркеров воспаления плазмы или бактериальной транслокации в селезенку и лимфатические узлы являются непрямыми 5,6. Другие методы могут быть инвазивными и трудоемкими. В этой статье описывается неинвазивный и экономически эффективный анализ, который непосредственно и количественно измеряет проницаемость кишечника. В этом анализе используется меченный флуоресцеин-изотиоцианатом декстран (FITC-декстран) для отслеживания проницаемости кишечника в режиме реального времени путем измерения флуоресценции in vivo. Кроме того, измерение уровня FITC-декстрана в плазме и кале количественно определяет проницаемость кишечника (рис. 1).
Анализ проницаемости FITC-декстрана ранее использовался во многих различных контекстах, в том числе на животных моделях болезни Паркинсона7, сепсиса8, ишемического инсульта9 и ожоговой травмы10. Кроме того, этот анализ недавно использовался, чтобы помочь понять, как микробиом кишечника может быть вовлечен в различные процессы заболевания и как он может быть нацелен или манипулирован в качестве потенциального терапевтического средства. Например, он использовался для изучения микробиома и терапии на основе микробиома в возрасте11 лет, ВЗК 12, колоректального рака 13 и расстройства аутистического спектра11. Поскольку барьерная функция кишечника участвует во многих аспектах здоровья и болезней, этот анализ широко используется. Его относительная простота и низкая нагрузка по времени делают его идеальным для тестирования условий in vivo, которые, как предполагается, изменяют целостность кишечного барьера. Его количественные результаты полезны для определения эффективности потенциального лечения.
В этом исследовании влияние диеты на барьерную функцию кишечника оценивали с помощью анализа FITC-декстрана. Сравнивали кишечную проницаемость мышей, получавших контрольную диету, и кишечную проницаемость мышей, получавших диету с добавлением инулина. Инулин является полезным олигосахаридом, который, как было показано, улучшает барьерную функцию кишечника12,13. Для измерений флуоресценции in vivo (фон) одна дополнительная необработанная мышь использовалась в качестве отрицательного контроля и получала PBS вместо FITC-декстрана. Этот эксперимент демонстрирует, что анализ FITC-декстрана является ценным инструментом для оценки проницаемости кишечника.
Барьерная функция кишечника является неотъемлемой частью многих различных болезненных процессов. Таким образом, оценка кишечной проницаемости неинвазивным, экономически эффективным и поддающимся количественной оценке способом имеет важное значение для точного представления этих заболеваний на животных моделях. Анализ FITC-декстрана предоставляет возможность для такого представления. Однако этот протокол включает в себя несколько важных шагов, которые необходимо выполнить точно для получения надежных результатов. Во-первых, важно обеспечить использование FITC-декстрана соответствующего размера. Для исследования проницаемости in vivo оптимальной молекулярной массой является FITC-декстран 4 кДа, и по мере увеличения молекулярной массы проницаемость уменьшаетсяв 15 раз. Таким образом, использование FITC-декстрана другой молекулярной массы может привести к запутанным или ненадежным результатам. Кроме того, важно отмечать время каждого зонда и соответствующим образом корректировать временные точки для сбора данных in vivo и сбора плазмы и фекалий. Например, если две мыши находятся на расстоянии 10 минут друг от друга, показания флуоресценции in vivo и сбор фекалий и плазмы также должны происходить с интервалом в 10 минут. Сравнение флуоресценции в одни и те же моменты времени позволяет более точно представить различия в проницаемости. Кроме того, порядок, в котором тестируются животные из разных групп, должен чередоваться, чтобы предотвратить эффект кластеризации из-за времени. Вместо того, чтобы сначала тестировать всех животных в группе A, а затем всех животных во второй группе B (AAABBB), рекомендуется переключать группу после каждого животного (ABABAB).
Этот анализ может быть изменен, чтобы включать только оценку образцов плазмы и фекалий, если нет доступа к аппарату визуализации. Хотя прямая флуоресцентная визуализация in vivo позволяет визуализировать потребление печени и остаточную абдоминальную флуоресценцию, оценка флуоресценции в образцах плазмы и фекалий по-прежнему обеспечивает количественное измерение проницаемости кишечника. Кроме того, как показал описанный эксперимент, уровни флуоресценции в плазме и кале хорошо коррелируют с визуализацией in vivo . Кроме того, этот анализ может быть модифицирован, чтобы включить только визуализацию in vivo . Это позволяет сохранить животных в живых, чтобы продолжить тестирование других параметров или следить за тем, как проницаемость кишечника изменяется с течением времени. Таким образом, возможность модифицировать этот анализ делает его доступным, но все же количественным. Наконец, дозировка 200 мкл 80 мг · мл -1 FITC-декстрана , вводимая каждой мыши, использовалась ранее и показала свою эффективность у мышей с небольшими различиями в массе тела16. Кроме того, важно отметить, что все мыши, использованные в репрезентативном разделе результатов, весили примерно 20 г, что позволяло использовать одинаковую дозировку для каждой мыши. Однако для учета различий в массе тела ФИТК-декстран можно вводить в дозировке 0,6-0,8 мг/г массы тела, например17. Важно отметить, что, независимо от используемой дозировки, важно ограничить количество зонда для каждой мыши до менее чем 10 мл · кг-1 , чтобы предотвратить осложнения или дискомфорт18.
Хотя анализ FITC-декстрана является эффективным методом оценки барьерной функции кишечника, он все же имеет некоторые ограничения. Одним из ограничений этой модели является то, что она требует голодания мышей в течение нескольких часов, а это означает, что ненадежно сравнивать эти результаты с результатами мышей, которые не голодали. Кроме того, голодание может повлиять на результаты в некоторых моделях, требующих строгого графика кормления, например, при измерении уровня глюкозы в крови на животных моделях диабета.
Несмотря на эти ограничения, анализ FITC-декстрана остается эффективным методом анализа кишечной проницаемости, поскольку он является количественным, универсальным, экономически эффективным и менее инвазивным, чем многие классические методы. Например, обычными зондами, используемыми для измерения проницаемости кишечника, являются небольшие датчики сахаридов или Cr-EDTA, которые имеют некоторые преимущества19. Однако некоторые датчики сахаридов имеют только региональную проницаемость. Поскольку они гидролизуются в дистальном отделе тонкой кишки, они не дают представления о проницаемости толстой кишки19. С другой стороны, Cr-EDTA может предоставить информацию о проницаемости толстой кишки, но требует измерений в течение 24 часов, что делает временную нагрузку этого метода намного выше, чем у анализа FITC-декстрана20. Кроме того, ни один из этих методов не обеспечивает прямой визуализации этого анализа in vivo . Таким образом, анализ FITC-декстрана обеспечивает относительно простой, прямой и эффективный вариант по сравнению с альтернативными методами измерения проницаемости кишечника.
Наконец, при таких патологических процессах, как ВЗК4, болезнь Альцгеймера21 и заболевание печени2, проницаемость кишечника является важным параметром, который можно измерить с помощью анализа FITC-декстрана для улучшения исследований. Например, при разработке новых методов лечения, таких как иммунотерапия для ВЗК, этот анализ может быть использован для проверки эффективности терапевтического средства для поддержания целостности кишечного барьера. Учитывая, что нарушение барьерной функции кишечника может быть связано с увековечиванием хронического воспаления при ЯК, например, важно изучить, насколько хорошо терапевтическое средство защищает от повышенной проницаемости4. Это только один пример, но анализ FITC-декстрана является доступным и поддающимся количественной оценке способом измерения проницаемости кишечника во многих различных областях и аспектах исследований.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была профинансирована за счет гранта Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (грант RGPIN-2018-06442 MMS). Мы благодарим животноводческое учреждение CRCHUM и доктора Цзюньчжэн Пэна из Платформы сердечно-сосудистого фенотипирования.
50 ppm Fe Diet (10% Inulin) | Envigo Teklad | TD.190651 | Representative Results |
50 ppm Fe Diet (FeSO4) | Envigo Teklad | TD.190723 | Representative Results |
BALB/c Mice 49-55 Days, Female | Charles River | 028BALB/C | Representative Results |
BD 1 mL Syringe Tuberculin Slip Tip | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For gavage |
BD Microtainer Tubes – With LH (Lithium Heparin) | Becton, Dickinson and Company | 365965 | For plasma collection |
Centrifuge 5420 | Eppendorf | S420KN605698 | |
Curved Gavage Needle (Gavage Cannula) 7.7.0 38 mm x 22 G | Harvard Apparatus Canada | 34-024 | No longer available – A potential alternative is available at Instech Labs (FTP-22-38) |
Euthanyl (Pentobarbital Sodium) 240 mg/mL | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 141704 | 1/100 dilution; Administered via intraperitoneal injection at 0.03 mL/g body weight |
FITC-dextran 4 | TdB Labs | 20550 | |
Heparinized Capillary Tubes | Kimble Chase Life Science and Research | 2501 | For retro-orbital blood collection |
Microplate, PS, 96-well, Flat-bottom (Chimney Well), Black, Flutrac, Med. Binding | Greiner Bio-one | 655076 | |
MiniARCO Clipper Kit | Kent Scientific | CL8787-KIT | For hair removal |
Optix MX2 and Optix Optiview | Advanced Research Technologies | 2.02.00.6 | Fluorescence imaging machine and software |
Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Wisent Inc | 311-010-LL | |
Puralube Vet Ointment | Dechra | 12920060 | Ophthalmic ointement to prevent eye damage during anesthesia |
Spark Multiplate Reader | Tecan | 30086376 |