In deze studie wordt fluoresceïne-isothiocyanaat-gelabeld (FITC) dextran toegediend aan muizen via orale maagsonde om de intestinale permeabiliteit zowel in vivo als in plasma- en fecale monsters te evalueren. Omdat de darmbarrièrefunctie in veel ziekteprocessen wordt beïnvloed, kan deze directe en kwantitatieve test in verschillende onderzoeksgebieden worden gebruikt.
Integriteit van de darmbarrière is een kenmerk van de darmgezondheid. Terwijl de integriteit van de darmbarrière kan worden beoordeeld met behulp van indirecte markers zoals de meting van plasma-ontstekingsmarkers en bacteriële translocatie naar de milt en lymfeklieren, kwantificeert de gouden standaard direct het vermogen van geselecteerde moleculen om de darmslijmvlieslaag te doorkruisen naar systemische circulatie. Dit artikel maakt gebruik van een niet-invasieve, kosteneffectieve en low-burden techniek om de intestinale permeabiliteit bij muizen te kwantificeren en in realtime te volgen met behulp van fluoresceïne-isothiocyanaat-gelabeld dextran (FITC-dextran). Voorafgaand aan orale suppletie met FITC-dextran zijn de muizen nuchter. Vervolgens worden ze voorzien van FITC-dextran verdund in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Een uur na de maagsonde worden de muizen onderworpen aan algemene anesthesie met behulp van isofluraan en wordt de in vivo fluorescentie gevisualiseerd in een beeldvormingskamer. Deze techniek is gericht op het beoordelen van restfluorescentie in de buikholte en de leveropname, wat wijst op portale migratie van de fluorescerende sonde. Bloed- en ontlastingsmonsters worden 4 uur na orale maagsonde verzameld en de muizen worden geofferd. Plasma- en fecale monsters verdund in PBS worden vervolgens verguld en de fluorescentie wordt geregistreerd. De concentratie van FITC-dextran wordt vervolgens berekend met behulp van een standaardcurve. In eerder onderzoek heeft in vivo beeldvorming aangetoond dat fluorescentie zich snel naar de lever verspreidt bij muizen met een zwakkere darmbarrière veroorzaakt door een vezelarm dieet, terwijl bij muizen aangevuld met vezels om de darmbarrière te versterken, het fluorescerende signaal meestal in het maagdarmkanaal wordt vastgehouden. Bovendien hadden controlemuizen in deze studie verhoogde plasmafluorescentie en verminderde fluorescentie in de ontlasting, terwijl omgekeerd aan inuline aangevulde muizen hogere niveaus van fluorescentiesignalen in de darm en lage niveaus in het plasma hadden. Samenvattend biedt dit protocol kwalitatieve en kwantitatieve metingen van intestinale permeabiliteit als een marker voor darmgezondheid.
De darmbarrière speelt een belangrijke rol bij zowel gezondheid als ziekte. Het vereist een complexe balans tussen het laten doordringen van de benodigde voedingsstoffen in de circulatie van het darmlumen en tegelijkertijd het voorkomen van de penetratie van pro-inflammatoire moleculen, zoals pathogenen of antigenen1. Verhoogde permeabiliteit kan worden veroorzaakt door vele gastro-intestinale stoornissen, zoals leverziekte of inflammatoire darmziekten (IBD’s)2,3. Bijvoorbeeld, bij colitis ulcerosa (UC), een IBD, leidt chronische ontsteking tot de afbraak van tight junctions, de daaropvolgende verstoring van de darmbarrière en de translocatie van bacteriën, waardoor mogelijk mucosale en systemische ontsteking wordt bestendigd4.
Integriteit van de darmbarrière is daarom een belangrijke marker voor de darmgezondheid. De huidige methoden voor het meten van de darmdoorlaatbaarheid hebben echter veel beperkingen. Methoden die plasma-ontstekingsmarkers of bacteriële translocatie naar de milt en lymfeklieren meten, zijn bijvoorbeeld indirect 5,6. Andere methoden kunnen invasief en tijdsintensief zijn. Dit artikel beschrijft een niet-invasieve en kosteneffectieve test die direct en kwantitatief de darmpermeabiliteit meet. Deze test maakt gebruik van fluoresceïne-isothiocyanaat-gelabeld dextran (FITC-dextran) om de darmpermeabiliteit in realtime te volgen door fluorescentie in vivo te meten. Bovendien kwantificeert het meten van FITC-dextranniveaus in het plasma en de ontlasting de darmpermeabiliteit (figuur 1).
De FITC-dextran permeabiliteitstest is eerder gebruikt in veel verschillende contexten, waaronder in diermodellen van de ziekte van Parkinson7, sepsis8, ischemische beroerte9 en brandwond10. Bovendien is deze test onlangs gebruikt om te helpen begrijpen hoe het darmmicrobioom betrokken kan zijn bij verschillende ziekteprocessen en hoe het kan worden gericht of gemanipuleerd als een potentieel therapeutisch middel. Het is bijvoorbeeld gebruikt om het microbioom en op het microbioom gebaseerde therapieën te bestuderen bij veroudering 11, IBD’s12, colorectale kanker13 en autismespectrumstoornis11. Omdat de darmbarrièrefunctie betrokken is bij tal van aspecten van gezondheid en ziekte, is deze test op grote schaal gebruikt. De relatieve eenvoud en lage tijdsbelasting maken het ideaal voor het testen van de in vivo omstandigheden waarvan wordt vermoed dat ze de integriteit van de darmbarrière veranderen. De kwantitatieve resultaten zijn nuttig voor het bepalen van de effectiviteit van een mogelijke behandeling.
In deze studie werd het effect van voeding op de darmbarrièrefunctie geëvalueerd met behulp van de FITC-dextran-test. De intestinale permeabiliteit van muizen die een controledieet kregen en de intestinale permeabiliteit van muizen die een inuline-aangevuld dieet kregen, werden vergeleken. Inuline is een gunstig oligosacharide waarvan is aangetoond dat het de darmbarrièrefunctie verbetert12,13. Voor in vivo fluorescentiemetingen (achtergrond) werd één extra onbehandelde muis gebruikt als negatieve controle en kreeg PBS in plaats van FITC-dextran. Dit experiment toont aan dat de FITC-dextran assay een waardevol hulpmiddel is voor het evalueren van de intestinale permeabiliteit.
De darmbarrièrefunctie is een integraal onderdeel van veel verschillende ziekteprocessen. Het beoordelen van de darmdoorlaatbaarheid op een niet-invasieve, kosteneffectieve en kwantificeerbare manier is dus essentieel voor het nauwkeurig weergeven van deze ziekten in diermodellen. De FITC-dextran assay biedt de mogelijkheid voor deze representatie. Dit protocol omvat echter verschillende kritieke stappen die nauwkeurig moeten worden voltooid om betrouwbare resultaten te verkrijgen. Ten eerste is het essentieel om ervoor te zorgen dat FITC-dextranten van de juiste grootte worden gebruikt. Voor het onderzoeken van in vivo permeabiliteit is 4 kDa FITC-dextran het optimale molecuulgewicht en naarmate het molecuulgewicht toeneemt, neemt de permeabiliteit af15. Het gebruik van FITC-dextran met een ander molecuulgewicht kan dus verwarrende of onbetrouwbare resultaten opleveren. Daarnaast is het belangrijk om de tijd van elke maagsonde te noteren en de tijdstippen voor in vivo gegevensverzameling en de verzameling van plasma en uitwerpselen dienovereenkomstig aan te passen. Als twee muizen bijvoorbeeld 10 minuten uit elkaar liggen, moeten de in vivo fluorescentiemetingen en het verzamelen van uitwerpselen en plasma ook 10 minuten uit elkaar plaatsvinden. Door de fluorescentie op dezelfde tijdstippen te vergelijken, kunnen de verschillen in permeabiliteit nauwkeuriger worden weergegeven. Bovendien moet de volgorde waarin de dieren uit verschillende groepen worden getest, worden afgewisseld om een clustereffect als gevolg van timing te voorkomen. In plaats van eerst alle dieren in groep A te testen en vervolgens alle dieren in groep B tweede (AAABBB), wordt aanbevolen om de groep na elk dier te wisselen (ABABAB).
Deze test kan worden aangepast om alleen de evaluatie van plasma- en fecale monsters op te nemen als er geen toegang is tot een beeldvormingsmachine. Hoewel directe fluorescentiebeeldvorming in vivo de visualisatie van leverinname en resterende abdominale fluorescentie mogelijk maakt, biedt het evalueren van fluorescentie in de plasma- en fecale monsters nog steeds een kwantitatieve meting van de darmpermeabiliteit. Bovendien, zoals aangetoond door het beschreven experiment, correleren de fluorescentieniveaus in het plasma en de ontlasting goed met de in vivo beeldvorming. Bovendien kan deze test worden aangepast om alleen de in vivo beeldvorming op te nemen. Hierdoor kunnen de dieren in leven worden gehouden om andere parameters te blijven testen of te controleren hoe de darmpermeabiliteit in de loop van de tijd verandert. De mogelijkheid om deze test te wijzigen, maakt het daarom toegankelijk, maar nog steeds kwantitatief. Ten slotte is de dosering van 200 μL van 80 mg·ml−1 FITC-dextran die aan elke muis is gegeven, eerder gebruikt en bleek deze effectief te zijn bij muizen met kleine verschillen in lichaamsgewicht16. Bovendien is het belangrijk op te merken dat alle muizen die in de representatieve resultatensectie werden gebruikt, ongeveer 20 g wogen, waardoor voor elke muis dezelfde dosering kon worden gebruikt. Om rekening te houden met verschillen in lichaamsgewicht, kan FITC-dextran echter worden toegediend in een dosering van 0,6-0,8 mg / g lichaamsgewicht, bijvoorbeeld17. Cruciaal is dat, ongeacht de gebruikte dosering, het belangrijk is om de hoeveelheid die aan elke muis wordt gegeven te beperken tot minder dan 10 ml · kg − 1 om complicaties of ongemak te voorkomen18.
Hoewel de FITC-dextran-test een effectieve methode biedt voor het evalueren van de darmbarrièrefunctie, heeft deze nog steeds enkele beperkingen. Een beperking van dit model is dat het vereist dat de muizen enkele uren worden vast, wat betekent dat het onbetrouwbaar is om deze resultaten te vergelijken met die van muizen die niet zijn gevast. Bovendien kan vasten de uitkomsten beïnvloeden in bepaalde modellen die strikte voedingsschema’s vereisen, zoals bij het meten van bloedglucose in diermodellen voor diabetes.
Ondanks deze beperkingen blijft de FITC-dextran-test een effectieve methode voor het analyseren van de darmpermeabiliteit, omdat deze kwantitatief, veelzijdig, kosteneffectief en minder invasief is dan veel klassieke methoden. Veel voorkomende sondes die worden gebruikt voor het meten van de darmdoorlaatbaarheid zijn bijvoorbeeld kleine saccharidesondes of Cr-EDTA, die enkele voordelen hebben19. Sommige saccharidesondes hebben echter alleen regiospecifieke permeabiliteit. Omdat ze in het distale deel van de dunne darm worden gehydrolyseerd, geven ze geen inzicht in de darmpermeabiliteit19. Aan de andere kant kan Cr-EDTA informatie geven over de permeabiliteit van de dikke darm, maar vereist metingen gedurende 24 uur, waardoor de tijdsbelasting van deze methode veel hoger is dan die van de FITC-dextran-assay20. Bovendien biedt geen van deze methoden de directe in vivo beeldvorming van deze test. Daarom biedt de FITC-dextran-test een relatief eenvoudige, directe en effectieve optie in vergelijking met alternatieve methoden voor het meten van de darmpermeabiliteit.
Ten slotte is in ziekteprocessen zoals IBD’s4, de ziekte van Alzheimer21 en leverziekte2 de darmpermeabiliteit een belangrijke parameter die kan worden gemeten met behulp van de FITC-dextran-test om studies te verbeteren. Bij het ontwikkelen van nieuwe behandelingen, zoals immunotherapieën voor IBD’s, kan deze test bijvoorbeeld worden gebruikt om de werkzaamheid van het therapeutische middel voor het behoud van de integriteit van de darmbarrière te testen. Gezien het feit dat een verminderde darmbarrièrefunctie betrokken kan zijn bij het bestendigen van de chronische ontsteking bij UC, bijvoorbeeld, is het belangrijk om te onderzoeken hoe goed een therapeutisch middel beschermt tegen verhoogde permeabiliteit4. Dit is slechts één voorbeeld, maar de FITC-dextran assay is een toegankelijke en kwantificeerbare manier om de darmpermeabiliteit te meten in veel verschillende gebieden en aspecten van onderzoek.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (subsidie RGPIN-2018-06442 aan MMS). We bedanken de dierenfaciliteit van het CRCHUM en Dr. Junzheng Peng van het Cardiovascular Phenotyping Platform.
50 ppm Fe Diet (10% Inulin) | Envigo Teklad | TD.190651 | Representative Results |
50 ppm Fe Diet (FeSO4) | Envigo Teklad | TD.190723 | Representative Results |
BALB/c Mice 49-55 Days, Female | Charles River | 028BALB/C | Representative Results |
BD 1 mL Syringe Tuberculin Slip Tip | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For gavage |
BD Microtainer Tubes – With LH (Lithium Heparin) | Becton, Dickinson and Company | 365965 | For plasma collection |
Centrifuge 5420 | Eppendorf | S420KN605698 | |
Curved Gavage Needle (Gavage Cannula) 7.7.0 38 mm x 22 G | Harvard Apparatus Canada | 34-024 | No longer available – A potential alternative is available at Instech Labs (FTP-22-38) |
Euthanyl (Pentobarbital Sodium) 240 mg/mL | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 141704 | 1/100 dilution; Administered via intraperitoneal injection at 0.03 mL/g body weight |
FITC-dextran 4 | TdB Labs | 20550 | |
Heparinized Capillary Tubes | Kimble Chase Life Science and Research | 2501 | For retro-orbital blood collection |
Microplate, PS, 96-well, Flat-bottom (Chimney Well), Black, Flutrac, Med. Binding | Greiner Bio-one | 655076 | |
MiniARCO Clipper Kit | Kent Scientific | CL8787-KIT | For hair removal |
Optix MX2 and Optix Optiview | Advanced Research Technologies | 2.02.00.6 | Fluorescence imaging machine and software |
Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Wisent Inc | 311-010-LL | |
Puralube Vet Ointment | Dechra | 12920060 | Ophthalmic ointement to prevent eye damage during anesthesia |
Spark Multiplate Reader | Tecan | 30086376 |