Dans la présente étude, le dextrane marqué à la fluorescéine-isothiocyanate (FITC) est administré à des souris par gavage oral pour évaluer la perméabilité intestinale à la fois in vivo et dans des échantillons plasmatiques et fécaux. Comme la fonction de barrière intestinale est affectée dans de nombreux processus pathologiques, ce test direct et quantitatif peut être utilisé dans divers domaines de recherche.
L’intégrité de la barrière intestinale est une caractéristique de la santé intestinale. Alors que l’intégrité de la barrière intestinale peut être évaluée à l’aide de marqueurs indirects tels que la mesure des marqueurs inflammatoires plasmatiques et la translocation bactérienne vers la rate et les ganglions lymphatiques, l’étalon-or quantifie directement la capacité des molécules sélectionnées à traverser la couche muqueuse intestinale vers la circulation systémique. Cet article utilise une technique non invasive, rentable et peu lourde pour quantifier et suivre en temps réel la perméabilité intestinale chez la souris utilisant du dextrane marqué à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC-dextran). Avant la supplémentation orale avec FITC-dextran, les souris sont à jeun. Ils sont ensuite gavés avec du FITC-dextran dilué dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Une heure après le gavage, les souris sont soumises à une anesthésie générale à l’isoflurane et la fluorescence in vivo est visualisée dans une chambre d’imagerie. Cette technique vise à évaluer la fluorescence résiduelle dans la cavité abdominale et l’absorption hépatique, ce qui suggère une migration porte de la sonde fluorescente. Des échantillons de sang et de selles sont prélevés 4 h après le gavage oral et les souris sont sacrifiées. Les échantillons de plasma et de matières fécales dilués dans du PBS sont ensuite plaqués et la fluorescence est enregistrée. La concentration de FITC-dextran est ensuite calculée à l’aide d’une courbe standard. Dans des recherches antérieures, l’imagerie in vivo a montré que la fluorescence se propage rapidement au foie chez les souris dont la barrière intestinale est plus faible induite par un régime pauvre en fibres, tandis que chez les souris supplémentées en fibres pour renforcer la barrière intestinale, le signal fluorescent est conservé principalement dans le tractus gastro-intestinal. En outre, dans cette étude, les souris témoins avaient une fluorescence plasmatique élevée et une fluorescence réduite dans les selles, tandis qu’inversement, les souris supplémentées en inuline avaient des niveaux plus élevés de signaux de fluorescence dans l’intestin et de faibles niveaux dans le plasma. En résumé, ce protocole fournit des mesures qualitatives et quantitatives de la perméabilité intestinale en tant que marqueur de la santé intestinale.
La barrière intestinale joue un rôle important à la fois dans la santé et la maladie. Il nécessite un équilibre complexe entre permettre aux nutriments nécessaires de pénétrer dans la circulation à partir de la lumière intestinale tout en empêchant simultanément la pénétration de molécules pro-inflammatoires, telles que les agents pathogènes ou les antigènes1. L’augmentation de la perméabilité peut être causée par de nombreux troubles gastro-intestinaux, tels que les maladies du foie ou les maladies inflammatoires de l’intestin (MII)2,3. Par exemple, dans la colite ulcéreuse (CU), une MII, l’inflammation chronique entraîne la rupture des jonctions serrées, la perturbation subséquente de la barrière intestinale et la translocation de bactéries, perpétuant potentiellement l’inflammation muqueuse et systémique4.
L’intégrité de la barrière intestinale est donc un marqueur important de la santé intestinale. Cependant, les méthodes actuelles de mesure de la perméabilité intestinale présentent de nombreuses limites. Par exemple, les méthodes mesurant les marqueurs inflammatoires plasmatiques ou la translocation bactérienne vers la rate et les ganglions lymphatiques sont indirectes 5,6. D’autres méthodes peuvent être invasives et prendre beaucoup de temps. Cet article décrit un test non invasif et rentable qui mesure directement et quantitativement la perméabilité intestinale. Ce test utilise du dextrane marqué à la fluorescéine-isothiocyanate (FITC-dextran) pour suivre la perméabilité intestinale en temps réel en mesurant la fluorescence in vivo. De plus, la mesure des taux de FITC-dextran dans le plasma et les fèces quantifie la perméabilité intestinale (Figure 1).
Le test de perméabilité FITC-dextran a déjà été utilisé dans de nombreux contextes différents, y compris dans des modèles animaux de la maladie de Parkinson7, de la septicémie8, de l’AVC ischémique9 et des brûlures10. De plus, ce test a été utilisé récemment pour aider à comprendre comment le microbiome intestinal peut être impliqué dans différents processus pathologiques et comment il peut être ciblé ou manipulé en tant que thérapeutique potentiel. Par exemple, il a été utilisé pour étudier le microbiome et les thérapies basées sur le microbiome dans le vieillissement 11, les MII12, le cancer colorectal 13 et le trouble du spectre autistique11. Comme la fonction de barrière intestinale est impliquée dans de nombreux aspects de la santé et de la maladie, ce test a été largement utilisé. Sa simplicité relative et sa faible charge temporelle le rendent idéal pour tester les conditions in vivo soupçonnées d’altérer l’intégrité de la barrière intestinale. Ses résultats quantitatifs sont utiles pour déterminer l’efficacité d’un traitement potentiel.
Dans cette étude, l’effet de l’alimentation sur la fonction de barrière intestinale a été évalué à l’aide du test FITC-dextran. La perméabilité intestinale des souris recevant un régime témoin et la perméabilité intestinale des souris recevant un régime supplémenté en inuline ont été comparées. L’inuline est un oligosaccharide bénéfique qui a été montré pour améliorer la fonction de barrière intestinale12,13. Pour les mesures de fluorescence in vivo (arrière-plan), une souris non traitée supplémentaire a été utilisée comme témoin négatif et a reçu du PBS au lieu de FITC-dextran. Cette expérience démontre que le test FITC-dextran est un outil précieux pour évaluer la perméabilité intestinale.
La fonction de barrière intestinale fait partie intégrante de nombreux processus pathologiques différents. Ainsi, l’évaluation de la perméabilité intestinale de manière non invasive, rentable et quantifiable est essentielle pour représenter avec précision ces maladies dans des modèles animaux. Le test FITC-dextran offre la possibilité de cette représentation. Cependant, ce protocole implique plusieurs étapes critiques qui doivent être complétées avec précision pour obtenir des résultats fiables. Tout d’abord, il est essentiel de garantir l’utilisation de FITC-dextran de taille appropriée. Pour l’examen de la perméabilité in vivo , 4 kDa FITC-dextran est le poids moléculaire optimal, et à mesure que le poids moléculaire augmente, la perméabilité diminue15. Ainsi, l’utilisation de FITC-dextran d’un poids moléculaire différent peut fournir des résultats confus ou peu fiables. De plus, il est important de noter l’heure de chaque gavage et d’ajuster les points temporels pour la collecte de données in vivo et la collecte de plasma et de matières fécales en conséquence. Par exemple, si deux souris sont gavées à 10 minutes d’intervalle, les lectures de fluorescence in vivo et la collecte des matières fécales et du plasma doivent également avoir lieu à 10 minutes d’intervalle. La comparaison de la fluorescence aux mêmes points temporels permet une représentation plus précise des différences de perméabilité. En outre, l’ordre dans lequel les animaux des différents groupes sont testés devrait être alterné afin d’éviter un effet de regroupement dû au calendrier. Au lieu de tester tous les animaux du groupe A en premier, puis tous les animaux du groupe B en second (AAABBB), il est recommandé de changer le groupe après chaque animal (ABABAB).
Ce test peut être modifié pour inclure uniquement l’évaluation des échantillons de plasma et de matières fécales s’il n’y a pas d’accès à un appareil d’imagerie. Bien que l’imagerie directe par fluorescence in vivo permette de visualiser l’apport hépatique et la fluorescence abdominale résiduelle, l’évaluation de la fluorescence dans les échantillons plasmatiques et fécaux fournit toujours une mesure quantitative de la perméabilité intestinale. De plus, comme l’a démontré l’expérience décrite, les niveaux de fluorescence dans le plasma et les fèces sont bien corrélés avec l’imagerie in vivo . De plus, ce test peut être modifié pour inclure uniquement l’imagerie in vivo . Cela permet aux animaux d’être maintenus en vie pour continuer à tester d’autres paramètres ou surveiller l’évolution de la perméabilité intestinale au fil du temps. La possibilité de modifier ce test le rend donc accessible, mais toujours quantitatif. Enfin, la dose de 200 μL de 80 mg·mL−1 FITC-dextran administrée à chaque souris a été utilisée précédemment et s’est révélée efficace chez les souris présentant de petites différences de poids corporel16. De plus, il est important de noter que toutes les souris utilisées dans la section des résultats représentatifs pesaient environ 20 g, ce qui permet d’utiliser le même dosage pour chaque souris. Pour tenir compte des différences de poids corporel, cependant, FITC-dextran peut être administré à une dose de 0,6-0,8 mg / g de poids corporel, par exemple17. Surtout, quelle que soit la dose utilisée, il est important de limiter la quantité gavée à chaque souris à moins de 10 mL·kg−1 pour prévenir les complications ou l’inconfort18.
Bien que le test FITC-dextran fournisse une méthode efficace pour évaluer la fonction de barrière intestinale, il présente encore certaines limites. L’une des limites de ce modèle est qu’il nécessite de jeûner les souris pendant plusieurs heures, ce qui signifie qu’il n’est pas fiable de comparer ces résultats à ceux de souris qui n’ont pas été à jeun. De plus, le jeûne peut affecter les résultats dans certains modèles qui nécessitent des horaires d’alimentation stricts, comme lors de la mesure de la glycémie dans des modèles animaux pour le diabète.
Malgré ces limites, le test FITC-dextran reste une méthode efficace pour analyser la perméabilité intestinale car il est quantitatif, polyvalent, rentable et moins invasif que de nombreuses méthodes classiques. Par exemple, les sondes couramment utilisées pour mesurer la perméabilité intestinale sont les petites sondes saccharidiques ou Cr-EDTA, qui présentent certains avantages19. Cependant, certaines sondes saccharidiques n’ont qu’une perméabilité spécifique à la région. Comme ils sont hydrolysés dans la partie distale de l’intestin grêle, ils ne donnent aucun aperçu de la perméabilité du côlon19. D’autre part, le Cr-EDTA peut fournir des informations sur la perméabilité du côlon mais nécessite des mesures pendant 24 heures, ce qui rend la charge temporelle de cette méthode beaucoup plus élevée que celle du test FITC-dextran20. De plus, aucune de ces méthodes ne fournit l’imagerie in vivo directe de ce test. Par conséquent, le test FITC-dextran offre une option relativement simple, directe et efficace par rapport aux méthodes alternatives de mesure de la perméabilité intestinale.
Enfin, dans les processus pathologiques tels que les MII4, la maladie d’Alzheimer21 et la maladie hépatique2, la perméabilité intestinale est un paramètre important qui pourrait être mesuré à l’aide du test FITC-dextran pour améliorer les études. Par exemple, dans le développement de nouveaux traitements, tels que les immunothérapies pour les MII, ce test peut être utilisé pour tester l’efficacité de la thérapie pour maintenir l’intégrité de la barrière intestinale. Étant donné que l’altération de la fonction de barrière intestinale peut être impliquée dans la perpétuation de l’inflammation chronique dans la colite ulcéreuse, par exemple, il est importantd’examiner dans quelle mesure une thérapie protège contre une perméabilité accrue 4. Ce n’est qu’un exemple, mais le test FITC-dextran est un moyen accessible et quantifiable de mesurer la perméabilité intestinale dans de nombreux domaines et aspects de la recherche.
The authors have nothing to disclose.
Ces travaux ont été financés par une subvention du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (subvention RGPIN-2018-06442 au SMM). Nous remercions l’animalerie du CRCHUM et le Dr Junzheng Peng de la Plateforme de phénotypage cardiovasculaire.
50 ppm Fe Diet (10% Inulin) | Envigo Teklad | TD.190651 | Representative Results |
50 ppm Fe Diet (FeSO4) | Envigo Teklad | TD.190723 | Representative Results |
BALB/c Mice 49-55 Days, Female | Charles River | 028BALB/C | Representative Results |
BD 1 mL Syringe Tuberculin Slip Tip | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For gavage |
BD Microtainer Tubes – With LH (Lithium Heparin) | Becton, Dickinson and Company | 365965 | For plasma collection |
Centrifuge 5420 | Eppendorf | S420KN605698 | |
Curved Gavage Needle (Gavage Cannula) 7.7.0 38 mm x 22 G | Harvard Apparatus Canada | 34-024 | No longer available – A potential alternative is available at Instech Labs (FTP-22-38) |
Euthanyl (Pentobarbital Sodium) 240 mg/mL | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 141704 | 1/100 dilution; Administered via intraperitoneal injection at 0.03 mL/g body weight |
FITC-dextran 4 | TdB Labs | 20550 | |
Heparinized Capillary Tubes | Kimble Chase Life Science and Research | 2501 | For retro-orbital blood collection |
Microplate, PS, 96-well, Flat-bottom (Chimney Well), Black, Flutrac, Med. Binding | Greiner Bio-one | 655076 | |
MiniARCO Clipper Kit | Kent Scientific | CL8787-KIT | For hair removal |
Optix MX2 and Optix Optiview | Advanced Research Technologies | 2.02.00.6 | Fluorescence imaging machine and software |
Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Wisent Inc | 311-010-LL | |
Puralube Vet Ointment | Dechra | 12920060 | Ophthalmic ointement to prevent eye damage during anesthesia |
Spark Multiplate Reader | Tecan | 30086376 |