フルオレセインイソチオシアネート標識デキストランを用いたマウスの腸バリア完全性の評価

すべての手順は、CRCHUMの施設内動物管理委員会による承認後、カナダ動物管理評議会のガイドラインに従って実行されました。商業的な情報源( 材料の表を参照)から入手した8週齢の雌のBALB / cマウスを本研究に使用しました。動物は2週間10%イヌリンwt / wtの栄養補助食品を受けました。対照群は、イヌリンサプリメントを欠いた同様の食事を受けました。マウスは食事に 自由 にアクセスできました。アッセイの概要を 図1に示します。 図1:FITCデキストランアッセイの概略図。経管栄養の4時間前にT−4-食物へのアクセスが除去された。T0-FITC−デキストランは、経口経管栄養を介して投与された。T1-経管栄養の1時間後、インビボ蛍光を評価した。T4-経管投与の4時間後、糞便および血漿サンプルを採取し、蛍光を測定した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 1.FITCデキストランの投与 FITC−デキストランを投与する前に、水への 自由 アクセスを維持しながらマウスを4時間絶食させる。注:断食は、できれば光サイクルの開始時(朝)に開始する必要があります。マウスは、食作用を制限するために、絶食中に寝具なしで新しいケージに移されてもよい。 滅菌した1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈した80 mg·mL−1 4 kDaのFITCデキストラン( 材料の表を参照)を200 μL調製します(マウスあたり)。投与直前にサンプルを新たに調製し、光から保護してください。 ボール型または洋ナシ型の先端を持つ38 mm 22 Gの滅菌された湾曲した経管栄養針を使用して、200 μLのFITCデキス トラン懸濁液を 経口強制投与して各マウスに投与します( 材料の表を参照)。最初の経管栄養後にタイマーを開始し、次のマウスを経管栄養化する前に5〜10分待って、 in vivo 測定を可能にし(ステップ2)、経管栄養後1時間を常に維持します。残りのFITCデキストラン懸濁液を標準曲線に保ちます。注:経管投与の直後に、糞便の形成を確実にするために食物を交換することができます。 2. 生体内 蛍光測定 経管投与の1時間後に、2.5%イソフルランまたは代替麻酔薬を使用してマウスを麻酔します。.つま先や尻尾をつまんで動物が適切に麻酔をかけられていることを確認し、動物が反応しないようにします。電気シェーバーを使用して腹部から毛皮を取り除き、乾燥を防ぐために眼科用潤滑軟膏を目にたっぷりと塗ります。次に、マウスを背側に横たわっているイメージングチャンバーに個別に配置します。注: in vivo イメージング中のバックグラウンドを説明するために、FITCデキストランの代わりにPBSまたは生理食塩水を投与するコントロールマウスを1つ含める必要があります。 蛍光イメージングチャンバーを用いてマウスを画像化する( 材料の表を参照)。レーザーの長さを470 nm、解像度を2.0 mmに設定して、腹部の画像を取得します。スタートボタンをクリックしたままにして、マシンとソフトウェアを起動します。システムをウォームアップします。注意: システムのウォームアップには20分以上かかる場合があるため、経管投与後1時間でマウスのイメージングを妨げないように、マシンを早めに起動する必要があります。 [ デバイスの状態 ]をクリックし、続行する前に、構成されているすべてのデバイスが「OK」と表示されていることを確認します。 必要に応じて、[レーザー 制御 ]をクリックして適切なレーザーをウォームアップし、目的のレーザー の[レーザー名 ]ボタンをクリックしてください。 新しい試験をクリックして、 新しい試験を開始します。適切なファイルの下に目的の名前で保存します。 研究オプションをクリックし、試験片IDを入力して、正しいレーザーと実験を選択します。 イメージングチャンバーを開き、動物をスキャンプレートの上に背側に置きます。手足と尾をテープで固定し、鼻と口が麻酔チューブにぴったりと収まるようにし、2.5%イソフルランを維持します。 スキャン領域が動物の正中線からわずかに腹側になるように、スキャンプレートの高さを調整します。イメージングチャンバー内の調整ノブを回してプレートを調整します。イメージングチャンバーのドアを閉じてロックします。 [描画] ツールを使用してスキャンする領域を選択します。肝臓のすぐ上から直腸までの腹部の全幅を含めます。[変更]ツールをクリックして、描画した領域を調整します。 スキャン解像度を2.0 mmに設定し、[ 次へ]をクリックします。電源の自動化が完了したら、設定が正しいことを確認し、必要な調整を行います。[ 開始 ]をクリックしてスキャンを開始します。 スキャンが完了したら、動物をイメージングチャンバーから取り出し、インキュベーターに入れて、麻酔から回復しながら体温を維持します。 [ 調査を続行 ]をクリックして設定を維持し、すべてのマウスがスキャンされるまで手順2.2.5〜2.2.10を繰り返します。 電源ボタンをクリックして3秒間押し続けると、イメージングチャンバーの電源が切れます。 使用した画像化システムに関連するソフトウェアを使用して、均一にスケーリングされた画像上の各動物および対照マウスの腹部蛍光を比較することにより蛍光を評価した( 材料の表を参照)。選択したファイル名で画像ファイルを見つけて開きます。設定が同期されているすべてのファイルを同時に開きます。 画像設定ツールバーを使用して、[ 画像の同期 ] ボタンと [スケールの同期] ボタンを使用して画像の設定を同期し、正確な比較を可能にします。 調整した縮尺で画像を保存します。 3. 糞便および血漿中の蛍光測定 経管投与の4時間後に滅菌チューブに各マウスから糞便ペレットを採取する。チューブを氷の上で暗闇に保ちます。 240 mg / mLのペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射 を介して マウスを麻酔します(希釈、1:100; 材料の表を参照)。0.03 mL / g体重の用量で投与します。.ガラス毛細管を眼窩後神経叢に挿入して凝固を防ぐために、ヘパリンまたはEDTAを含む血漿収集用に作られたチューブで少なくとも700μLの血液サンプルを収集します( 材料の表を参照)14。注:採血の代替方法には、心臓穿刺または尾静脈からの離脱が含まれます。これは末期処置であるため、マウスは頸部脱臼または代替の人道的方法 を介して 安楽死させる必要があります。安楽死に関する地元の動物倫理委員会の推奨事項に従ってください。 血液サンプルを9,390 x g で室温で10分間遠心分離します。血漿を新しい滅菌チューブに移し、氷上で暗所に保管します。 50 mgの糞便サンプルを200 μLの1x PBSで希釈し、血漿を1x PBSで1:2に希釈します。希釈比は、蛍光シグナルの強度に基づいて変更することができる。 1x PBS中のFITCデキストランの段階希釈を使用して検量線を生成します。最高濃度の20 mg·mL−1 FITCデキストランから始めて、1:1の係数で連続して7〜10倍に希釈します。注:したがって、濃度は20 mg·mL-1、10 mg·mL-1、5 mg·mL-1、2.5 mg·mL-1、1.25 mg·mL-1、0.625 mg·mL-1、0.3125 mg·mL-1などを読み取る必要があります。 100 μLのサンプルと標準物質を不透明な黒色の96ウェルプレートにプレートします。PBS ブランクを含めます。蛍光プレートリーダー( 材料表を参照)で、530 nmの吸収と485 nmの励起で蛍光を読み取ります。注:サンプルと標準物質は、重複または三重にメッキすることができ、その後、それらの蛍光値が平均化されます。 蛍光を既知の標準曲線の濃度と比較することにより、サンプルあたりのFITCデキストランの濃度を決定します。サンプルでは、濃度に希釈係数を掛けます(ステップ3.5)。