Bu çalışma, zebra balığı embriyolarına transgenik yapılar oluşturmak ve enjekte etmek için ağ geçidi tabanlı bir klonlama yöntemi olan modüler Tol2 transgenez sistemi için bir protokolü açıklamaktadır.
Fetal alkol spektrum bozuklukları (FASD), prenatal etanol maruziyetine bağlı olarak ortaya çıkan oldukça değişken yapısal bozukluklar ve bilişsel bozukluklar ile karakterizedir. FASD’nin karmaşık patolojisi nedeniyle, hayvan modellerinin etanol kaynaklı gelişimsel kusurlar hakkındaki mevcut anlayışımız için kritik olduğu kanıtlanmıştır. Zebra balığının, zebra balığı ve insanlar arasındaki hem genetiğin hem de gelişimin yüksek derecede korunması nedeniyle etanol kaynaklı gelişimsel kusurları incelemek için güçlü bir model olduğu kanıtlanmıştır. Model bir sistem olarak, zebra balığı, genetik olarak izlenebilir ve yarı saydam olan çok sayıda harici olarak döllenmiş embriyo da dahil olmak üzere, onları gelişimsel çalışmalar için ideal kılan birçok özelliğe sahiptir. Bu, araştırmacıların çoklu genetik bağlamlarda etanol maruziyetinin zamanlamasını ve dozajını hassas bir şekilde kontrol etmelerini sağlar. Zebra balığında bulunan önemli bir genetik araç transgenezdir. Bununla birlikte, transgenik yapılar oluşturmak ve transgenik çizgiler oluşturmak karmaşık ve zor olabilir. Bu sorunu ele almak için, zebra balığı araştırmacıları transpozon tabanlı Tol2 transgenez sistemini kurdular. Bu modüler sistem, eksiksiz Tol2 transpozon tabanlı transgenik yapıların hızlı montajı için çok bölgeli bir Ağ Geçidi klonlama yaklaşımı kullanır. Burada, esnek Tol2 sistem araç kutusunu ve zebra balığı transgenezi için hazır transgenik yapılar oluşturmak için bir protokolü ve bunların etanol çalışmalarında kullanımını açıklıyoruz.
Prenatal etanol maruziyeti, fetal alkol spektrum bozuklukları (FASD) olarak adlandırılan yapısal eksikliklerin ve bilişsel bozuklukların sürekliliğine yol açar1,2,3,4. Birden fazla faktör arasındaki karmaşık ilişkiler, insanlarda FASD’nin etiyolojisini incelemeyi ve anlamayı zorlaştırmaktadır. Bu zorluğu çözmek için çok çeşitli hayvan modelleri kullanılmıştır. Bu modellerde bulunan biyolojik ve deneysel araçlar, etanol teratojenitesinin mekanik temeli hakkındaki anlayışımızı geliştirmede çok önemli olduğunu kanıtlamıştır ve bu model sistemlerinden elde edilen sonuçlar, insan etanol çalışmalarında bulunanlarla oldukça tutarlıdır 5,6. Bunlar arasında, zebra balığı, kısmen dış döllenmeleri, yüksek doğurganlıkları, genetik izlenebilirlikleri ve yarı saydam embriyoları nedeniyle etanol teratogenezi 7,8’i incelemek için güçlü bir model olarak ortaya çıkmıştır. Bu güçlü yönler, zebra balığını, transgenik zebra balığı hatlarını kullanarak FASD’nin gerçek zamanlı canlı görüntüleme çalışmaları için ideal hale getirmek için bir araya gelir.
Transgenik zebra balığı, embriyonik gelişimin birçok yönünü incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır9. Bununla birlikte, transgenik yapılar ve müteakip transgenik çizgiler oluşturmak son derece zor olabilir. Standart bir transgen, transgeni ve bir poli A sinyalini veya “kuyruğunu” sürmek için aktif bir promotör eleman gerektirir, bunların hepsi genel vektör bakımı için kararlı bir bakteriyel vektördedir. Çok bileşenli bir transgenik yapının geleneksel üretimi, çok zaman alıcı alt klonlama adımları gerektirir10. Gibson montajı gibi PCR tabanlı yaklaşımlar, alt klonlama ile ilgili bazı sorunları atlatabilir. Bununla birlikte, her benzersiz transgenik yapı10’un üretimi için benzersiz astarlar tasarlanmalı ve test edilmelidir. Transgen yapımının ötesinde, genomik entegrasyon, germline iletimi ve uygun transgen entegrasyonu için tarama da zor olmuştur. Burada, transpozon tabanlı Tol2 transgenez sistemini (Tol2Kit) kullanmak için bir protokol açıklıyoruz10,11. Bu modüler sistem, sürekli genişleyen “giriş” ve “hedef” vektörleri kütüphanesinden hızlı bir şekilde çoklu transgenik yapılar oluşturmak için çok bölgeli Ağ Geçidi klonlamasını kullanır. Entegre Tol2 transpoze edilebilir elementler, transgenez oranını büyük ölçüde artırarak, çoklu transgenlerin hızlı bir şekilde oluşturulmasına ve genomik entegrasyonuna izin verir. Bu sistemi kullanarak, bir endoderm transgenik zebra balığı hattının oluşturulmasının, FASD’nin altında yatan dokuya özgü yapısal kusurları incelemek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Nihayetinde, bu protokolde, modüler kurulumun ve transgenik yapıların inşasının zebra balığı tabanlı FASD araştırmalarına büyük ölçüde yardımcı olacağını gösteriyoruz.
Zebra balığı, etanol maruziyetinin gelişim ve hastalık durumları üzerindeki etkisini incelemek için idealdir 7,8. Zebra balığı, çok sayıda yarı saydam, harici olarak döllenmiş, genetik olarak izlenebilir embriyolar üretir, bu da birden fazla çevresel bağlamda aynı anda birkaç transgen etiketli doku ve hücre tipinin canlı görüntülenmesine izin verir 19,20. Bu güçlü yönler, ins…
The authors have nothing to disclose.
Bu makalede sunulan araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri / Ulusal Alkol Kötüye Kullanımı Enstitüsü (NIH / NIAAA) R00AA023560’tan C.B.L.’ye bir hibe ile desteklenmiştir.
Addgene Tol2 toolbox | https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/ | ||
Air | Provided directly by the university | ||
Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary | FHC | 30-30-0 | |
Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
Chloramphenicol | BioVision | 2486 | |
EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
Fluorescent Dissecting Microscope | Olympus | SZX16 | |
Kanamycin | Fisher Scientific | BP906 | |
Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
Lawsone Lab Donor Plasmid Prep | https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/ | ||
LB Agar | Fisher Scientific | BP9724 | |
LB Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
LR Clonase II Plus Enzyme | Fisher Scientific | 12538200 | |
Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
Micro Pipette holder | Applied Scientific Instrumentation | MIMPH-M-PIP | |
Microcentrifuge tube 0.5 mL | VWR | 10025-724 | |
Microcentrifuge tube 1.5 mL | VWR | 10025-716 | |
Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Fisher Scientific | AM1340 | |
Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet | https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1 | ||
NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | |
NcoI | NEB | R0189S | |
NotI | NEB | R0189S | |
Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
Phenol Red sodium salt | Sigma Aldrich | P4758-5G | |
Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
Stericup .22 µm vacuum filtration system | Millipore | SCGPU11RE | |
Tol2 Wiki Page | http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page | ||
Top10 Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C404010 | |
Vertical Pipetter Puller | David Kopf Instruments | 720 | |
Zebrafish microinjection mold | Adaptive Science Tools | i34 |