نظام الزرد Tol2: نهج وراثي معياري ومرن قائم على البوابة
Summary
يصف هذا العمل بروتوكولا لنظام التحوير المعياري Tol2 ، وهو طريقة استنساخ قائمة على البوابة لإنشاء وحقن تركيبات معدلة وراثيا في أجنة الزرد.
Abstract
تتميز اضطرابات طيف الكحول الجنيني (FASD) بمجموعة متغيرة للغاية من العيوب الهيكلية والإعاقات المعرفية التي تنشأ بسبب التعرض للإيثانول قبل الولادة. نظرا لعلم الأمراض المعقد ل FASD ، أثبتت النماذج الحيوانية أهميتها لفهمنا الحالي للعيوب التنموية التي يسببها الإيثانول. أثبت الزرد أنه نموذج قوي لفحص العيوب التنموية التي يسببها الإيثانول بسبب الدرجة العالية من الحفاظ على كل من الوراثة والتنمية بين الزرد والبشر. كنظام نموذجي ، تمتلك أسماك الزرد العديد من السمات التي تجعلها مثالية للدراسات التنموية ، بما في ذلك أعداد كبيرة من الأجنة المخصبة خارجيا والتي تكون شفافة وراثيا. وهذا يسمح للباحثين بالتحكم بدقة في توقيت وجرعة التعرض للإيثانول في سياقات جينية متعددة. إحدى الأدوات الوراثية المهمة المتاحة في الزرد هي الجينات المحورة. ومع ذلك ، فإن توليد تركيبات معدلة وراثيا وإنشاء خطوط محورة وراثيا يمكن أن يكون معقدا وصعبا. لمعالجة هذه المشكلة ، أنشأ باحثو الزرد نظام التحوير Tol2 القائم على الترانسبوزون. يستخدم هذا النظام المعياري نهج استنساخ بوابة متعدد المواقع للتجميع السريع للتركيبات المعدلة وراثيا الكاملة القائمة على Tol2. هنا ، نصف صندوق أدوات نظام Tol2 المرن وبروتوكول لتوليد تركيبات معدلة وراثيا جاهزة لجين الزرد المحورة واستخدامها في دراسات الإيثانول.
Introduction
يؤدي التعرض للإيثانول قبل الولادة إلى سلسلة متصلة من العجز الهيكلي والإعاقات المعرفية تسمى اضطرابات طيف الكحول الجنيني (FASD) 1،2،3،4. العلاقات المعقدة بين عوامل متعددة تجعل دراسة وفهم مسببات FASD في البشر صعبة. لحل هذا التحدي ، تم استخدام مجموعة متنوعة من النماذج الحيوانية. أثبتت الأدوات البيولوجية والتجريبية المتاحة في هذه النماذج أنها حاسمة في تطوير فهمنا للأساس الميكانيكي للإيثانول المسخي ، وكانت النتائج من هذه الأنظمة النموذجية متسقة بشكل ملحوظ مع ما هو موجود في دراسات الإيثانول البشرية 5,6. من بين هؤلاء ، برزت أسماك الزرد كنموذج قوي لدراسة تكوين الإيثانولالمسخي 7,8 ، ويرجع ذلك جزئيا إلى الإخصاب الخارجي ، والخصوبة العالية ، وقابلية السحب الوراثي ، والأجنة الشفافة. تتحد نقاط القوة هذه لجعل الزرد مثاليا لدراسات التصوير الحية في الوقت الفعلي ل FASD باستخدام خطوط الزرد المعدلة وراثيا.
تم استخدام الزرد المعدل وراثيا على نطاق واسع لدراسة جوانب متعددة من التطور الجنيني9. ومع ذلك ، فإن إنشاء تركيبات معدلة وراثيا وخطوط معدلة وراثيا لاحقة يمكن أن يكون صعبا للغاية. يتطلب جين التحوير القياسي عنصر محفز نشط لدفع جين التحوير وإشارة بولي أ أو “ذيل” ، كل ذلك في ناقل بكتيري مستقر لصيانة النواقل العامة. يتطلب الجيل التقليدي من بنية محورة وراثية متعددة المكونات خطوات استنساخ فرعية متعددة تستغرقوقتا طويلا 10. ويمكن للنهج القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل، مثل تجميع جيبسون، أن تتحايل على بعض المسائل المرتبطة بالاستنساخ الفرعي. ومع ذلك ، يجب تصميم واختبار الاشعال الفريدة لتوليد كل بنية معدلة وراثيا فريدة10. وبعيدا عن بناء الجينات المحورة، كان التكامل الجينومي، وانتقال الخط الجرثومي، وفحص التكامل السليم لجينات التحوير أمرا صعبا أيضا. هنا ، نصف بروتوكولا لاستخدام نظام التحوير Tol2 القائم على الترانسبوزون (Tol2Kit) 10,11. يستخدم هذا النظام المعياري استنساخ بوابة متعددة المواقع لإنشاء تركيبات متعددة معدلة وراثيا بسرعة من مكتبة دائمة التوسع من متجهات “الدخول” و “الوجهة”. تزيد عناصر Tol2 المدمجة القابلة للنقل بشكل كبير من معدل الجينات المحورة ، مما يسمح بالبناء السريع والتكامل الجيني لجينات التحوير المتعددة. باستخدام هذا النظام ، نوضح كيف يمكن استخدام توليد خط الزرد المعدل وراثيا للأديم الباطن لدراسة العيوب الهيكلية الخاصة بالأنسجة الكامنة وراء FASD. في النهاية ، في هذا البروتوكول ، نظهر أن الإعداد المعياري وبناء التركيبات المعدلة وراثيا سيساعد بشكل كبير في أبحاث FASD القائمة على الزرد.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعتبر الزرد مناسبا بشكل مثالي لدراسة تأثير التعرض للإيثانول على حالات النمووالمرض 7,8. ينتج الزرد أعدادا كبيرة من الأجنة الشفافة والمخصبة خارجيا والقابلة للسحب وراثيا ، مما يسمح بالتصوير الحي للعديد من الأنسجة وأنواع الخلايا الموسومة بالجينات المحورة في و…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم البحث المقدم في هذه المقالة بمنحة من المعاهد الوطنية للصحة / المعهد الوطني لتعاطي الكحول (NIH / NIAAA) R00AA023560 إلى C.B.L.
Materials
| Addgene Tol2 toolbox | https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/ | ||
| Air | Provided directly by the university | ||
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary | FHC | 30-30-0 | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Chloramphenicol | BioVision | 2486 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| Lawsone Lab Donor Plasmid Prep | https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/ | ||
| LB Agar | Fisher Scientific | BP9724 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| LR Clonase II Plus Enzyme | Fisher Scientific | 12538200 | |
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Micro Pipette holder | Applied Scientific Instrumentation | MIMPH-M-PIP | |
| Microcentrifuge tube 0.5 mL | VWR | 10025-724 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | VWR | 10025-716 | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Fisher Scientific | AM1340 | |
| Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet | https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1 | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | |
| NcoI | NEB | R0189S | |
| NotI | NEB | R0189S | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma Aldrich | P4758-5G | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Stericup .22 µm vacuum filtration system | Millipore | SCGPU11RE | |
| Tol2 Wiki Page | http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page | ||
| Top10 Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C404010 | |
| Vertical Pipetter Puller | David Kopf Instruments | 720 | |
| Zebrafish microinjection mold | Adaptive Science Tools | i34 |
References
- Denny, L., Coles, S., Blitz, R. Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders. American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).
- Popova, S., et al. Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis. The Lancet. 387 (10022), 978-987 (2016).
- Wilhoit, L. F., Scott, D. A., Simecka, B. A. Fetal alcohol spectrum disorders: Characteristics, complications, and treatment. Community Mental Health Journal. 53, 711-718 (2017).
- Wozniak, J. R., Riley, E. P., Charness, M. E. Clinical presentation, diagnosis, and management of fetal alcohol spectrum disorder. The Lancet Neurology. 18 (8), 760-770 (2019).
- Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A Comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
- Lovely, C. B. Animal models of gene-alcohol interactions. Birth Defects Research. 112 (4), 367-379 (2020).
- Fernandes, Y., Lovely, C. B. Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders. Genesis. 59 (11), 23460 (2021).
- Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
- Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab Animal Research. 37 (1), 26 (2021).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit forTol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Don, E. K., et al. A Tol2 gateway-compatible toolbox for the study of the nervous system and neurodegenerative disease. Zebrafish. 14 (1), 69-72 (2017).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Protocols. UMass Chan Medical School Available from: https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols (2017)
- Mosimann, C. Multisite gateway calculations: Excel spreadsheet. protocols.io. , (2022).
- Chung, W. -. S., Stainier, D. Y. R. Intra-endodermal interactions are required for pancreatic β cell induction. Developmental Cell. 14 (4), 582-593 (2008).
- Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (3), 325-332 (2010).
- Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish. Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).
- Silva Brito, R., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends. Science of The Total Environment. 848, 157665 (2022).
- Lai, K. P., Gong, Z., Tse, W. K. F. Zebrafish as the toxicant screening model: Transgenic and omics approaches. Aquatic Toxicology. 234, 105813 (2021).
- Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109 (3), 577-584 (1988).
- Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103 (2), 403-412 (1990).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system. Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).
