El sistema Zebrafish Tol2: un enfoque de transgénesis modular y flexible basado en pasarelas

La exposición prenatal al etanol da lugar a un continuo de déficits estructurales y deficiencias cognitivas denominadas trastornos del espectro alcohólico fetal (TEAF)1,2,3,4. Las complejas relaciones entre múltiples factores hacen que estudiar y comprender la etiología del TEAF en humanos sea un desafío. Para resolver este desafío, se ha utilizado una amplia variedad de modelos animales. Las herramientas biológicas y experimentales disponibles en estos modelos han demostrado ser cruciales para desarrollar nuestra comprensión de las bases mecanicistas de la teratogenicidad del etanol, y los resultados de estos sistemas modelo han sido notablemente consistentes con lo que se encuentra en los estudios de etanol humano ^5,6. Entre estos, el pez cebra se ha convertido en un poderoso modelo para estudiar la teratogénesis del etanol^7,8, en parte debido a su fertilización externa^, alta fecundidad, trazabilidad genética y embriones translúcidos. Estas fortalezas se combinan para hacer que el pez cebra sea ideal para estudios de imágenes en vivo en tiempo real de TEAF utilizando líneas transgénicas de pez cebra.

El pez cebra transgénico se ha utilizado ampliamente para estudiar múltiples aspectos del desarrollo embrionario⁹. Sin embargo, la creación de construcciones transgénicas y líneas transgénicas posteriores puede ser extremadamente difícil. Un transgén estándar requiere un elemento promotor activo para impulsar el transgén y una señal poli A o “cola”, todo en un vector bacteriano estable para el mantenimiento general del vector. La generación tradicional de una construcción transgénica multicomponente requiere múltiples pasos de subclonación que consumen mucho tiempo¹⁰. Los enfoques basados en PCR, como el ensamblaje de Gibson, pueden eludir algunos de los problemas asociados con la subclonación. Sin embargo, los cebadores únicos deben ser diseñados y probados para la generación de cada construcción transgénica única¹⁰. Más allá de la construcción de transgenes, la integración genómica, la transmisión de la línea germinal y la detección de la integración adecuada de transgenes también han sido difíciles. Aquí, describimos un protocolo para usar el sistema de transgénesis Tol2 basado en transposones (Tol2Kit)^10,11. Este sistema modular utiliza la clonación de pasarela multisitio para generar rápidamente múltiples construcciones transgénicas a partir de una biblioteca en constante expansión de vectores de “entrada” y “destino”. Los elementos transponibles Tol2 integrados aumentan en gran medida la tasa de transgénesis, lo que permite la rápida construcción e integración genómica de múltiples transgenes. Usando este sistema, mostramos cómo la generación de una línea de pez cebra transgénico endodermo se puede utilizar para estudiar los defectos estructurales específicos del tejido subyacentes al TEAF. En última instancia, en este protocolo, mostramos que la configuración modular y la construcción de construcciones transgénicas ayudarán enormemente a la investigación del TEAF basada en el pez cebra.