Zebrafish Tol2 시스템: 유연한 모듈식 게이트웨이 기반 트랜스제네시스 접근 방식

태아기 에탄올 노출은 태아 알코올 스펙트럼 장애(FASD)라고 하는 구조적 결함 및 인지 장애의 연속체를 유발합니다^.1,2,3,4. 여러 요인 간의 복잡한 관계는 인간에서 FASD의 병인을 연구하고 이해하는 것을 어렵게 만듭니다. 이 문제를 해결하기 위해 다양한 동물 모델이 사용되었습니다. 이 모델에서 사용할 수 있는 생물학적 및 실험적 도구는 에탄올 기형 유발성의 기계론적 기초에 대한 우리의 이해를 발전시키는 데 중요한 것으로 입증되었으며, 이러한 모델 시스템의 결과는 인간 에탄올 연구에서 발견된 것과 현저하게 일치했습니다 ^5,6. 이 중 제브라피쉬는 에탄올 기형 형성을 연구하는 강력한 모델로 부상했습니다.^7,8, 부분적으로는 외부 수정^, 높은 번식력, 유전적 다루기 쉬움 및 반투명 배아로 인해 발생합니다. 이러한 강점이 결합되어 제브라피쉬는 형질전환 제브라피쉬 계통을 사용한 FASD의 실시간 라이브 이미징 연구에 이상적입니다.

형질전환 제브라피쉬는 배아 발달의 여러 측면을 연구하는 데 광범위하게 사용되어 왔다⁹. 그러나 형질전환 구조체 및 후속 형질전환 계통을 만드는 것은 매우 어려울 수 있습니다. 표준 이식유전자는 이식유전자를 구동하기 위한 활성 프로모터 요소와 폴리 A 신호 또는 “꼬리”를 필요로 하며, 모두 일반적인 벡터 유지를 위해 안정적인 박테리아 벡터에서 필요합니다. 다성분 형질전환 구축물의 전통적인 생성은 여러 시간이 소요되는 서브클로닝 단계(sub-cloning steps^{)를 필요로 한다(10}). Gibson 어셈블리와 같은 PCR 기반 접근 방식은 하위 복제와 관련된 일부 문제를 우회할 수 있습니다. 그러나, 독특한 프라이머는 모든 독특한 형질전환 구축물¹⁰의 생성을 위해 설계되고 시험되어야 한다. 이식유전자 구성 외에도 게놈 통합, 생식계열 전달 및 적절한 이식유전자 통합을 위한 스크리닝도 어려웠습니다. 여기서는 트랜스포존 기반 Tol2 형질전환 시스템(Tol2Kit)을 사용하기 위한 프로토콜을 설명합니다^(10,11). 이 모듈식 시스템은 다중 사이트 게이트웨이 클로닝을 사용하여 계속 확장되는 “진입” 및 “대상” 벡터 라이브러리에서 여러 형질전환 구조를 신속하게 생성합니다. 통합된 Tol2 전치 가능한 요소는 형질전환 속도를 크게 증가시켜 여러 형질전환 유전자의 신속한 구성 및 게놈 통합을 가능하게 합니다. 이 시스템을 사용하여 우리는 내배엽 형질전환 제브라피쉬 계통의 생성이 FASD의 기초가 되는 조직 특이적 구조적 결함을 연구하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다. 궁극적으로, 이 프로토콜에서 우리는 모듈식 설정과 형질전환 구조의 구성이 제브라피쉬 기반 FASD 연구에 크게 도움이 될 것임을 보여줍니다.