Summary

Le système Tol2 du poisson zèbre : une approche de transgénèse modulaire et flexible basée sur une passerelle

Published: November 30, 2022
doi:

Summary

Ce travail décrit un protocole pour le système modulaire de transgénèse Tol2, une méthode de clonage basée sur une passerelle pour créer et injecter des constructions transgéniques dans des embryons de poisson zèbre.

Abstract

Les troubles causés par l’alcoolisation fœtale (ETCAF) sont caractérisés par un ensemble très variable de défauts structurels et de déficiences cognitives qui surviennent en raison de l’exposition prénatale à l’éthanol. En raison de la pathologie complexe de l’ETCAF, les modèles animaux se sont révélés essentiels à notre compréhension actuelle des défauts de développement induits par l’éthanol. Le poisson zèbre s’est avéré être un modèle puissant pour examiner les défauts de développement induits par l’éthanol en raison du degré élevé de conservation de la génétique et du développement entre le poisson zèbre et les humains. En tant que système modèle, le poisson zèbre possède de nombreux attributs qui le rendent idéal pour les études de développement, y compris un grand nombre d’embryons fécondés à l’extérieur qui sont génétiquement traitables et translucides. Cela permet aux chercheurs de contrôler avec précision le moment et le dosage de l’exposition à l’éthanol dans de multiples contextes génétiques. Un outil génétique important disponible chez le poisson zèbre est la transgénèse. Cependant, générer des constructions transgéniques et établir des lignées transgéniques peut être complexe et difficile. Pour résoudre ce problème, les chercheurs sur le poisson zèbre ont établi le système de transgénèse Tol2 basé sur des transposons. Ce système modulaire utilise une approche de clonage de passerelle multisite pour l’assemblage rapide de constructions transgéniques complètes basées sur des transposons Tol2. Ici, nous décrivons la boîte à outils flexible du système Tol2 et un protocole pour générer des constructions transgéniques prêtes pour la transgénèse du poisson zèbre et leur utilisation dans les études sur l’éthanol.

Introduction

L’exposition prénatale à l’éthanol donne lieu à un continuum de déficits structurels et de déficiences cognitives appelés troubles causés par l’alcoolisation fœtale (ETCAF)1,2,3,4. Les relations complexes entre de multiples facteurs rendent difficile l’étude et la compréhension de l’étiologie de l’ETCAF chez les humains. Pour résoudre ce problème, une grande variété de modèles animaux ont été utilisés. Les outils biologiques et expérimentaux disponibles dans ces modèles se sont avérés cruciaux pour développer notre compréhension de la base mécaniste de la tératogénicité de l’éthanol, et les résultats de ces systèmes modèles ont été remarquablement cohérents avec ce que l’on trouve dans les études sur l’éthanol humain 5,6. Parmi ceux-ci, le poisson zèbre est apparu comme un modèle puissant pour étudier la tératogenèse de l’éthanol 7,8, en partie en raison de leur fécondation externe, de leur fécondité élevée, de leur traçabilité génétique et de leurs embryons translucides. Ces forces se combinent pour rendre le poisson zèbre idéal pour les études d’imagerie en temps réel de l’ETCAF à l’aide de lignées de poissons-zèbres transgéniques.

Le poisson-zèbre transgénique a été largement utilisé pour étudier de multiples aspects du développement embryonnaire9. Cependant, la création de constructions transgéniques et de lignées transgéniques ultérieures peut être extrêmement difficile. Un transgène standard nécessite un élément promoteur actif pour piloter le transgène et un signal poly A ou « queue », le tout dans un vecteur bactérien stable pour le maintien général du vecteur. La génération traditionnelle d’une construction transgénique à plusieurs composants nécessite plusieurs étapes de sous-clonagechronophages 10. Les approches basées sur la PCR, telles que l’assemblage Gibson, peuvent contourner certains des problèmes associés au sous-clonage. Cependant, des amorces uniques doivent être conçues et testées pour la génération de chaque construction transgénique unique10. Au-delà de la construction transgénique, l’intégration génomique, la transmission germinale et le criblage d’une intégration correcte des transgènes ont également été difficiles. Ici, nous décrivons un protocole d’utilisation du système de transgénèse Tol2 basé sur des transposons (Tol2Kit)10,11. Ce système modulaire utilise le clonage de passerelle multisite pour générer rapidement plusieurs constructions transgéniques à partir d’une bibliothèque en constante expansion de vecteurs « d’entrée » et de « destination ». Les éléments transposables Tol2 intégrés augmentent considérablement le taux de transgénèse, permettant la construction rapide et l’intégration génomique de plusieurs transgènes. À l’aide de ce système, nous montrons comment la génération d’une lignée de poisson-zèbre transgénique endodermique peut être utilisée pour étudier les défauts structurels spécifiques aux tissus sous-jacents à l’ETCAF. En fin de compte, dans ce protocole, nous montrons que la configuration modulaire et la construction de constructions transgéniques aideront grandement la recherche sur l’ETCAF à base de poisson zèbre.

Protocol

Tous les embryons de poisson zèbre utilisés dans cette procédure ont été élevés et élevés conformément aux protocoles IACUCétablis 12. Ces protocoles ont été approuvés par l’Université de Louisville. NOTE: La souche de poisson-zèbre de type sauvage, AB, et la lignée double mutante bmp4st72;smad5b1100 ont été utilisées dans cette étude. Toute l’eau utilisée dans cette procédure était de l’eau stérile par osmos…

Representative Results

Pour générer les constructions transgéniques, nous avons utilisé le système de transgénèse Tol2. Trois vecteurs d’entrée, dont p5E, qui contient les éléments promoteur/amplificateur de gène, pME, qui contient le gène à exprimer par les éléments promoteurs/amplificateurs, et p3E qui, au minimum, détient la queue polyA, ont été utilisés pour générer la construction transgénique via le clonage LR de passerelle multisite. Le vecteur de destination, pDest, fournit les répétitions Tol2 pour l…

Discussion

Le poisson zèbre est idéal pour étudier l’impact de l’exposition à l’éthanol sur le développement et les états pathologiques 7,8. Le poisson zèbre produit un grand nombre d’embryons translucides, fécondés à l’extérieur et génétiquement traitables, ce qui permet l’imagerie en direct de plusieurs tissus et types de cellules marqués par des transgènes simultanément dans de multiples contextes environnementaux19,20

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La recherche présentée dans cet article a été soutenue par une subvention des National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 à CBL.

Materials

Addgene Tol2 toolbox https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/
Air Provided directly by the university
Ampicillin Fisher Scientific BP1760
Analytical Balance VWR 10204-962
Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary FHC 30-30-0
Calcium Chloride VWR 97062-590
Chloramphenicol BioVision 2486
EDTA Fisher Scientific BP118-500
Fluorescent Dissecting Microscope Olympus SZX16
Kanamycin Fisher Scientific BP906
Laser Scanning Confocal Microscope Olympus Fluoview FV1000
Lawsone Lab Donor Plasmid Prep https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/
LB Agar Fisher Scientific BP9724
LB Broth Fisher Scientific BP1426
Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose Fisher Scientific BP160-500
LR Clonase II Plus Enzyme Fisher Scientific 12538200
Magnesium Sulfate (Heptahydrate) Fisher Scientific M63-500
Micro Pipette holder Applied Scientific Instrumentation MIMPH-M-PIP
Microcentrifuge tube 0.5 mL  VWR 10025-724
Microcentrifuge tube 1.5 mL  VWR 10025-716
Micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33
Micropipette tips 10 μL  Fisher Scientific 13611106
Micropipette tips 1000 μL  Fisher Scientific 13611127
Micropipette tips 200 μL  Fisher Scientific 13611112
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Fisher Scientific AM1340
Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1
NanoDrop Spectrophotometer NanoDrop ND-1000
NcoI NEB R0189S
NotI NEB R0189S
Petri dishes 100 mm  Fisher Scientific FB012924
Phenol Red sodium salt Sigma Aldrich P4758-5G
Pipetman L p1000L Micropipette Gilson FA10006M
Pipetman L p200L Micropipette Gilson FA10005M
Pipetman L p2L Micropipette Gilson FA10001M
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-500
Potassium Phosphate (Dibasic) VWR BDH9266-500G
Pressure Injector Applied Scientific Instrumentation MPPI-3
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106
Sodium Bicarbonate VWR BDH9280-500G
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-500
Sodium Phosphate (Dibasic) Fisher Scientific S374-500
Stericup .22 µm vacuum filtration system  Millipore SCGPU11RE
Tol2 Wiki Page http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page
Top10 Chemically Competent E. coli Fisher Scientific C404010
Vertical Pipetter Puller David Kopf Instruments 720
Zebrafish microinjection mold Adaptive Science Tools i34

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Cite This Article
Klem, J. R., Gray, R., Lovely, C. B. The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach. J. Vis. Exp. (189), e64679, doi:10.3791/64679 (2022).

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