Система Zerio Tol2: модульный и гибкий подход к трансгенезу на основе шлюза
Summary
В этой работе описывается протокол модульной системы трансгенеза Tol2, метода клонирования на основе шлюза для создания и введения трансгенных конструкций в эмбрионы рыбок данио.
Abstract
Расстройства алкогольного спектра плода (FASD) характеризуются сильно варьирующимся набором структурных дефектов и когнитивных нарушений, которые возникают из-за пренатального воздействия этанола. Из-за сложной патологии ФАСН животные модели оказались критически важными для нашего нынешнего понимания дефектов развития, вызванных этанолом. Рыбки данио-рерио оказались мощной моделью для изучения дефектов развития, вызванных этанолом, из-за высокой степени сохранения как генетики, так и развития между рыбками данио-рерио и людьми. Как модельная система, рыбки данио-рерио обладают многими атрибутами, которые делают их идеальными для исследований развития, включая большое количество внешне оплодотворенных эмбрионов, которые генетически поддаются обработке и полупрозрачны. Это позволяет исследователям точно контролировать время и дозировку воздействия этанола в нескольких генетических контекстах. Одним из важных генетических инструментов, доступных у рыбок данио, является трансгенез. Однако создание трансгенных конструкций и установление трансгенных линий может быть сложным и трудным. Чтобы решить эту проблему, исследователи рыбок данио-рерио создали систему трансгенеза Tol2 на основе транспозонов. Эта модульная система использует многосайтовый подход клонирования шлюза для быстрой сборки полных трансгенных конструкций на основе транспозонов Tol2. Здесь мы описываем гибкий набор инструментов системы Tol2 и протокол для создания трансгенных конструкций, готовых к трансгенезу рыбок данио, и их использования в исследованиях этанола.
Introduction
Пренатальное воздействие этанола приводит к континууму структурных дефицитов и когнитивных нарушений, называемых расстройствами алкогольного спектра плода (FASD)1,2,3,4. Сложные взаимосвязи между несколькими факторами затрудняют изучение и понимание этиологии ФАСН у людей. Для решения этой проблемы были использованы самые разные модели животных. Биологические и экспериментальные инструменты, доступные в этих моделях, оказались решающими в развитии нашего понимания механистической основы тератогенности этанола, и результаты этих модельных систем удивительно согласуются с тем, что было обнаружено в исследованиях этанола на людях 5,6. Среди них рыбки данио-рерио стали мощной моделью для изучения тератогенезаэтанола 7,8, отчасти из-за их внешнего оплодотворения, высокой плодовитости, генетической обрабатываемости и полупрозрачных эмбрионов. Эти сильные стороны в совокупности делают рыбок данио-рерио идеальными для исследований ФАСН в реальном времени с использованием трансгенных линий рыбок данио.
Трансгенные рыбки данио-рерио широко используются для изучения многочисленных аспектов эмбрионального развития9. Однако создание трансгенных конструкций и последующих трансгенных линий может быть чрезвычайно трудным. Стандартный трансген требует активного промоторного элемента для управления трансгеном и поли-А-сигнала или «хвоста», и все это в стабильном бактериальном векторе для общего поддержания вектора. Традиционная генерация многокомпонентной трансгенной конструкции требует нескольких трудоемких этапов субклонирования10. Подходы, основанные на ПЦР, такие как сборка Гибсона, могут обойти некоторые проблемы, связанные с субклонированием. Тем не менее, уникальные праймеры должны быть разработаны и испытаны для генерации каждой уникальной трансгенной конструкции10. Помимо конструирования трансгенов, геномная интеграция, передача зародышевой линии и скрининг на надлежащую интеграцию трансгенов также были затруднены. Здесь мы описываем протокол использования системы трансгенеза Tol2 на основе транспозонов (Tol2Kit)10,11. Эта модульная система использует многосайтовое клонирование шлюза для быстрого создания нескольких трансгенных конструкций из постоянно расширяющейся библиотеки векторов «входа» и «назначения». Интегрированные переносимые элементы Tol2 значительно увеличивают скорость трансгенеза, обеспечивая быстрое построение и геномную интеграцию нескольких трансгенов. Используя эту систему, мы показываем, как генерация трансгенной линии эндодермы данио-рерио может быть использована для изучения тканеспецифических структурных дефектов, лежащих в основе FASD. В конечном счете, в этом протоколе мы показываем, что модульная установка и построение трансгенных конструкций значительно помогут исследованиям ФАСН на основе рыбок данио.
Protocol
Representative Results
Discussion
Рыбки данио-рерио идеально подходят для изучения влияния воздействия этанола на развитие и болезненные состояния 7,8. Рыбки данио-рерио производят большое количество полупрозрачных, оплодотворенных, генетически обрабатываемых эмбрионов, что позволяет ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследование, представленное в этой статье, было поддержано грантом Национального института здравоохранения / Национального института по борьбе со злоупотреблением алкоголем (NIH / NIAAA) R00AA023560 для C.B.L.
Materials
| Addgene Tol2 toolbox | https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/ | ||
| Air | Provided directly by the university | ||
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary | FHC | 30-30-0 | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Chloramphenicol | BioVision | 2486 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| Lawsone Lab Donor Plasmid Prep | https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/ | ||
| LB Agar | Fisher Scientific | BP9724 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| LR Clonase II Plus Enzyme | Fisher Scientific | 12538200 | |
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Micro Pipette holder | Applied Scientific Instrumentation | MIMPH-M-PIP | |
| Microcentrifuge tube 0.5 mL | VWR | 10025-724 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | VWR | 10025-716 | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Fisher Scientific | AM1340 | |
| Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet | https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1 | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | |
| NcoI | NEB | R0189S | |
| NotI | NEB | R0189S | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma Aldrich | P4758-5G | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Stericup .22 µm vacuum filtration system | Millipore | SCGPU11RE | |
| Tol2 Wiki Page | http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page | ||
| Top10 Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C404010 | |
| Vertical Pipetter Puller | David Kopf Instruments | 720 | |
| Zebrafish microinjection mold | Adaptive Science Tools | i34 |
References
- Denny, L., Coles, S., Blitz, R. Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders. American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).
- Popova, S., et al. Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis. The Lancet. 387 (10022), 978-987 (2016).
- Wilhoit, L. F., Scott, D. A., Simecka, B. A. Fetal alcohol spectrum disorders: Characteristics, complications, and treatment. Community Mental Health Journal. 53, 711-718 (2017).
- Wozniak, J. R., Riley, E. P., Charness, M. E. Clinical presentation, diagnosis, and management of fetal alcohol spectrum disorder. The Lancet Neurology. 18 (8), 760-770 (2019).
- Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A Comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
- Lovely, C. B. Animal models of gene-alcohol interactions. Birth Defects Research. 112 (4), 367-379 (2020).
- Fernandes, Y., Lovely, C. B. Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders. Genesis. 59 (11), 23460 (2021).
- Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
- Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab Animal Research. 37 (1), 26 (2021).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit forTol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Don, E. K., et al. A Tol2 gateway-compatible toolbox for the study of the nervous system and neurodegenerative disease. Zebrafish. 14 (1), 69-72 (2017).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Protocols. UMass Chan Medical School Available from: https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols (2017)
- Mosimann, C. Multisite gateway calculations: Excel spreadsheet. protocols.io. , (2022).
- Chung, W. -. S., Stainier, D. Y. R. Intra-endodermal interactions are required for pancreatic β cell induction. Developmental Cell. 14 (4), 582-593 (2008).
- Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (3), 325-332 (2010).
- Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish. Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).
- Silva Brito, R., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends. Science of The Total Environment. 848, 157665 (2022).
- Lai, K. P., Gong, Z., Tse, W. K. F. Zebrafish as the toxicant screening model: Transgenic and omics approaches. Aquatic Toxicology. 234, 105813 (2021).
- Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109 (3), 577-584 (1988).
- Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103 (2), 403-412 (1990).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system. Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).
