O Sistema Zebrafish Tol2: Uma Abordagem de Transgênese Modular e Flexível Baseada em Gateway

A exposição pré-natal ao etanol dá origem a um continuum de déficits estruturais e comprometimentos cognitivos denominados transtornos do espectro alcoólico fetal (TEAF)^1,2,3,4. As complexas relações entre múltiplos fatores tornam o estudo e a compreensão da etiologia do TEAF em humanos um desafio. Para resolver esse desafio, uma grande variedade de modelos animais tem sido utilizada. As ferramentas biológicas e experimentais disponíveis nesses modelos têm se mostrado cruciais no desenvolvimento de nossa compreensão das bases mecanicistas da teratogenicidade do etanol, e os resultados desses sistemas modelo têm sido notavelmente consistentes com o que é encontrado em estudos com etanol humano ^5,6. Dentre estes, o zebrafish tem emergido como um poderoso modelo para o estudo da teratogênese do etanol7,8, em parte devido à sua fecundação externa^, alta fecundidade, tratabilidade genética e embriões translúcidos. Esses pontos fortes se combinam para tornar o peixe-zebra ideal para estudos de imagem ao vivo em tempo real do FASD usando linhas transgênicas de peixe-zebra.

O peixe-zebra transgênico tem sido extensivamente utilizado para estudar múltiplos aspectos do desenvolvimento embrionário⁹. No entanto, criar construções transgênicas e linhas transgênicas subsequentes pode ser extremamente difícil. Um transgene padrão requer um elemento promotor ativo para conduzir o transgene e um sinal poli A ou “cauda”, tudo em um vetor bacteriano estável para manutenção geral do vetor. A geração tradicional de uma construção transgênica multicomponente requer várias etapas demoradas de subclonagem¹⁰. Abordagens baseadas em PCR, como a montagem Gibson, podem contornar alguns dos problemas associados à subclonagem. No entanto, primers únicos devem ser projetados e testados para a geração de cada construção transgênica única¹⁰. Além da construção de transgenes, a integração genômica, a transmissão germinativa e a triagem para a integração adequada de transgenes também têm sido difíceis. Descrevemos aqui um protocolo para utilização do sistema de transgênese Tol2 baseado em transposon (Tol2Kit)^10,11. Este sistema modular usa clonagem de Gateway multissite para gerar rapidamente várias construções transgênicas a partir de uma biblioteca em constante expansão de vetores de “entrada” e “destino”. Os elementos transponíveis integrados Tol2 aumentam consideravelmente a taxa de transgênese, permitindo a rápida construção e integração genômica de múltiplos transgenes. Usando este sistema, mostramos como a geração de uma linhagem de zebrafish transgênico endoderme pode ser usada para estudar os defeitos estruturais tecido-específicos subjacentes ao TEAF. Em última análise, neste protocolo, mostramos que a configuração modular e a construção de construções transgênicas ajudarão muito a pesquisa de FASD baseada em peixe-zebra.