Il sistema Zebrafish Tol2: un approccio di transgenesi modulare e flessibile basato su gateway

L’esposizione prenatale all’etanolo dà origine a un continuum di deficit strutturali e disturbi cognitivi definiti disturbi dello spettro alcolico fetale (FASD)1,2,3,4. Le complesse relazioni tra molteplici fattori rendono difficile lo studio e la comprensione dell’eziologia della FASD negli esseri umani. Per risolvere questa sfida, è stata utilizzata un’ampia varietà di modelli animali. Gli strumenti biologici e sperimentali disponibili in questi modelli si sono dimostrati cruciali nello sviluppo della nostra comprensione delle basi meccanicistiche della teratogenicità dell’etanolo e i risultati di questi sistemi modello sono stati notevolmente coerenti con ciò che si trova negli studi sull’etanolo umano ^5,6. Tra questi, i pesci zebra sono emersi come un potente modello per studiare la teratogenesi dell’etanolo^7,8, in parte a causa della loro fecondazione esterna, alta fecondità^, trattabilità genetica ed embrioni traslucidi. Questi punti di forza si combinano per rendere il pesce zebra ideale per studi di imaging live in tempo reale di FASD utilizzando linee di zebrafish transgeniche.

I pesci zebra transgenici sono stati ampiamente utilizzati per studiare molteplici aspetti dello sviluppo embrionale⁹. Tuttavia, la creazione di costrutti transgenici e successive linee transgeniche può essere estremamente difficile. Un transgene standard richiede un elemento promotore attivo per guidare il transgene e un segnale o “coda” poli A, il tutto in un vettore batterico stabile per il mantenimento generale del vettore. La generazione tradizionale di un costrutto transgenico multicomponente richiede più fasi di sub-clonazione che richiedono molto tempo¹⁰. Gli approcci basati sulla PCR, come l’assemblaggio Gibson, possono aggirare alcuni dei problemi associati alla subclonazione. Tuttavia, primer unici devono essere progettati e testati per la generazione di ogni costrutto transgenico unico¹⁰. Oltre alla costruzione del transgene, anche l’integrazione genomica, la trasmissione della linea germinale e lo screening per una corretta integrazione transgenica sono stati difficili. Qui, descriviamo un protocollo per l’utilizzo del sistema di transgenesi Tol2 basato su trasposone (Tol2Kit)^10,11. Questo sistema modulare utilizza la clonazione multisito di gateway per generare rapidamente più costrutti transgenici da una libreria in continua espansione di vettori “ingresso” e “destinazione”. Gli elementi trasponibili Tol2 integrati aumentano notevolmente il tasso di transgenesi, consentendo la rapida costruzione e integrazione genomica di più transgeni. Utilizzando questo sistema, mostriamo come la generazione di una linea di zebrafish transgenico endoderma può essere utilizzata per studiare i difetti strutturali tessuto-specifici alla base della FASD. In definitiva, in questo protocollo, dimostriamo che la configurazione modulare e la costruzione di costrutti transgenici aiuteranno notevolmente la ricerca FASD basata sul pesce zebra.