Het Zebrafish Tol2-systeem: een modulaire en flexibele gateway-gebaseerde transgenesebenadering
Summary
Dit werk beschrijft een protocol voor het modulaire Tol2-transgenesesysteem, een gateway-gebaseerde kloonmethode om transgene constructies in zebravisembryo’s te creëren en te injecteren.
Abstract
Foetale alcoholspectrumstoornissen (FASD) worden gekenmerkt door een zeer variabele reeks structurele defecten en cognitieve stoornissen die optreden als gevolg van prenatale blootstelling aan ethanol. Vanwege de complexe pathologie van FASD zijn diermodellen van cruciaal belang gebleken voor ons huidige begrip van door ethanol geïnduceerde ontwikkelingsdefecten. Zebravissen hebben bewezen een krachtig model te zijn om door ethanol geïnduceerde ontwikkelingsdefecten te onderzoeken vanwege de hoge mate van behoud van zowel genetica als ontwikkeling tussen zebravissen en mensen. Als modelsysteem bezitten zebravissen veel eigenschappen die ze ideaal maken voor ontwikkelingsstudies, waaronder grote aantallen uitwendig bevruchte embryo’s die genetisch traceerbaar en doorschijnend zijn. Dit stelt onderzoekers in staat om de timing en dosering van blootstelling aan ethanol in meerdere genetische contexten nauwkeurig te regelen. Een belangrijk genetisch hulpmiddel dat beschikbaar is bij zebravissen is transgenese. Het genereren van transgene constructies en het vaststellen van transgene lijnen kan echter complex en moeilijk zijn. Om dit probleem aan te pakken, hebben zebravisonderzoekers het op transposon gebaseerde Tol2-transgenesesysteem opgezet. Dit modulaire systeem maakt gebruik van een multisite Gateway-kloonbenadering voor de snelle assemblage van complete Tol2 transposon-gebaseerde transgene constructies. Hier beschrijven we de flexibele Tol2-systeemtoolbox en een protocol voor het genereren van transgene constructies die klaar zijn voor zebravistransgenese en hun gebruik in ethanolstudies.
Introduction
Prenatale blootstelling aan ethanol geeft aanleiding tot een continuüm van structurele tekorten en cognitieve stoornissen die foetale alcoholspectrumstoornissen (FASD) worden genoemd1,2,3,4. De complexe relaties tussen meerdere factoren maken het bestuderen en begrijpen van de etiologie van FASD bij mensen een uitdaging. Om deze uitdaging op te lossen, is een grote verscheidenheid aan diermodellen gebruikt. De biologische en experimentele hulpmiddelen die beschikbaar zijn in deze modellen zijn cruciaal gebleken bij het ontwikkelen van ons begrip van de mechanistische basis van ethanolteratogeniciteit, en de resultaten van deze modelsystemen zijn opmerkelijk consistent met wat wordt gevonden in humane ethanolstudies 5,6. Onder deze zijn zebravissen naar voren gekomen als een krachtig model om ethanolteratogenese7,8 te bestuderen, deels vanwege hun externe bevruchting, hoge vruchtbaarheid, genetische tractie en doorschijnende embryo’s. Deze sterke punten combineren om zebravissen ideaal te maken voor real-time live beeldvormingsstudies van FASD met behulp van transgene zebravislijnen.
Transgene zebravissen zijn op grote schaal gebruikt om meerdere aspecten van de embryonale ontwikkeling te bestuderen9. Het creëren van transgene constructies en daaropvolgende transgene lijnen kan echter buitengewoon moeilijk zijn. Een standaard transgen vereist een actief promotorelement om het transgen en een poly A-signaal of “staart” aan te sturen, allemaal in een stabiele bacteriële vector voor algemeen vectoronderhoud. De traditionele generatie van een multi-component transgeen construct vereist meerdere tijdrovende sub-klonenstappen 10. PCR-gebaseerde benaderingen, zoals Gibson-assemblage, kunnen enkele van de problemen in verband met subklonen omzeilen. Unieke primers moeten echter worden ontworpen en getest voor het genereren van elke unieke transgene constructie10. Naast transgenconstructie zijn genomische integratie, kiembaantransmissie en screening op een goede transgenintegratie ook moeilijk geweest. Hier beschrijven we een protocol voor het gebruik van het transposon-gebaseerde Tol2-transgenesesysteem (Tol2Kit)10,11. Dit modulaire systeem maakt gebruik van multisite Gateway-klonen om snel meerdere transgene constructies te genereren uit een steeds groter wordende bibliotheek van “entry” en “destination” vectoren. Geïntegreerde Tol2 transponeerbare elementen verhogen de snelheid van transgenese aanzienlijk, waardoor de snelle constructie en genomische integratie van meerdere transgenen mogelijk is. Met behulp van dit systeem laten we zien hoe de generatie van een endoderm transgene zebravislijn kan worden gebruikt om de weefselspecifieke structurele defecten die ten grondslag liggen aan FASD te bestuderen. Uiteindelijk laten we in dit protocol zien dat de modulaire opzet en de constructie van transgene constructies het op zebravissen gebaseerde FASD-onderzoek enorm zal helpen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebravissen zijn bij uitstek geschikt voor het bestuderen van de impact van blootstelling aan ethanol op ontwikkeling en ziektetoestanden 7,8. Zebravissen produceren grote aantallen doorschijnende, extern bevruchte, genetisch verhandelbare embryo’s, waardoor verschillende transgen-gelabelde weefsels en celtypen tegelijkertijd in meerdere omgevingscontexten live kunnen worden afgebeeld19,20. Deze sterke pu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het onderzoek dat in dit artikel wordt gepresenteerd, werd ondersteund door een subsidie van de National Institutes of Health / National Institute on Alcohol Abuse (NIH / NIAAA) R00AA023560 aan C.B.L.
Materials
| Addgene Tol2 toolbox | https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/ | ||
| Air | Provided directly by the university | ||
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary | FHC | 30-30-0 | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Chloramphenicol | BioVision | 2486 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| Lawsone Lab Donor Plasmid Prep | https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/ | ||
| LB Agar | Fisher Scientific | BP9724 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| LR Clonase II Plus Enzyme | Fisher Scientific | 12538200 | |
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Micro Pipette holder | Applied Scientific Instrumentation | MIMPH-M-PIP | |
| Microcentrifuge tube 0.5 mL | VWR | 10025-724 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | VWR | 10025-716 | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Fisher Scientific | AM1340 | |
| Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet | https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1 | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | |
| NcoI | NEB | R0189S | |
| NotI | NEB | R0189S | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma Aldrich | P4758-5G | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Stericup .22 µm vacuum filtration system | Millipore | SCGPU11RE | |
| Tol2 Wiki Page | http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page | ||
| Top10 Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C404010 | |
| Vertical Pipetter Puller | David Kopf Instruments | 720 | |
| Zebrafish microinjection mold | Adaptive Science Tools | i34 |
References
- Denny, L., Coles, S., Blitz, R. Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders. American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).
- Popova, S., et al. Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis. The Lancet. 387 (10022), 978-987 (2016).
- Wilhoit, L. F., Scott, D. A., Simecka, B. A. Fetal alcohol spectrum disorders: Characteristics, complications, and treatment. Community Mental Health Journal. 53, 711-718 (2017).
- Wozniak, J. R., Riley, E. P., Charness, M. E. Clinical presentation, diagnosis, and management of fetal alcohol spectrum disorder. The Lancet Neurology. 18 (8), 760-770 (2019).
- Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A Comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
- Lovely, C. B. Animal models of gene-alcohol interactions. Birth Defects Research. 112 (4), 367-379 (2020).
- Fernandes, Y., Lovely, C. B. Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders. Genesis. 59 (11), 23460 (2021).
- Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
- Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab Animal Research. 37 (1), 26 (2021).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit forTol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Don, E. K., et al. A Tol2 gateway-compatible toolbox for the study of the nervous system and neurodegenerative disease. Zebrafish. 14 (1), 69-72 (2017).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Protocols. UMass Chan Medical School Available from: https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols (2017)
- Mosimann, C. Multisite gateway calculations: Excel spreadsheet. protocols.io. , (2022).
- Chung, W. -. S., Stainier, D. Y. R. Intra-endodermal interactions are required for pancreatic β cell induction. Developmental Cell. 14 (4), 582-593 (2008).
- Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (3), 325-332 (2010).
- Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish. Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).
- Silva Brito, R., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends. Science of The Total Environment. 848, 157665 (2022).
- Lai, K. P., Gong, Z., Tse, W. K. F. Zebrafish as the toxicant screening model: Transgenic and omics approaches. Aquatic Toxicology. 234, 105813 (2021).
- Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109 (3), 577-584 (1988).
- Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103 (2), 403-412 (1990).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system. Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).
