מערכת Tol2 של דג הזברה: גישת טרנסגנזה מודולרית וגמישה מבוססת שער
Summary
עבודה זו מתארת פרוטוקול למערכת טרנסגנזה מודולרית Tol2, שיטת שיבוט מבוססת שער ליצירה והזרקה של מבנים טרנסגניים לעוברים של דגי זברה.
Abstract
הפרעות בספקטרום האלכוהול העוברי (FASD) מאופיינות במערך משתנה מאוד של פגמים מבניים וליקויים קוגניטיביים הנובעים מחשיפה לאתנול לפני הלידה. בשל הפתולוגיה המורכבת של FASD, מודלים של בעלי חיים הוכיחו את עצמם כקריטיים להבנתנו הנוכחית של פגמים התפתחותיים הנגרמים על ידי אתנול. דגי זברה הוכיחו את עצמם כמודל רב עוצמה לבחינת פגמים התפתחותיים הנגרמים על ידי אתנול בשל רמת השימור הגבוהה הן של גנטיקה והן של התפתחות בין דגי זברה לבני אדם. כמערכת מודל, לדגי זברה יש תכונות רבות שהופכות אותם לאידיאליים למחקרים התפתחותיים, כולל מספר רב של עוברים מופרים חיצונית שהם ניתנים למשיכה גנטית ושקופים. זה מאפשר לחוקרים לשלוט במדויק על העיתוי והמינון של חשיפה לאתנול בהקשרים גנטיים מרובים. אחד הכלים הגנטיים החשובים הזמינים בדגי זברה הוא טרנסגנזה. עם זאת, יצירת מבנים טרנסגניים והקמת קווים טרנסגניים יכולה להיות מורכבת וקשה. כדי להתמודד עם בעיה זו, חוקרי דגי זברה הקימו את מערכת הטרנסגנזה Tol2 המבוססת על טרנספוזון. מערכת מודולרית זו משתמשת בגישת שיבוט שער מרובה אתרים להרכבה מהירה של מבנים טרנסגניים שלמים מבוססי טרנספוזון Tol2. במאמר זה אנו מתארים את ארגז הכלים הגמיש של מערכת Tol2 ופרוטוקול ליצירת מבנים טרנסגניים המוכנים לטרנסגנזה של דגי זברה והשימוש בהם במחקרי אתנול.
Introduction
חשיפה לאתנול טרום לידתי מולידה רצף של ליקויים מבניים וליקויים קוגניטיביים המכונים הפרעות ספקטרום אלכוהול עוברי (FASD)1,2,3,4. היחסים המורכבים בין גורמים מרובים הופכים את לימוד והבנת האטיולוגיה של FASD בבני אדם למאתגרים. כדי לפתור את האתגר הזה, נעשה שימוש במגוון רחב של מודלים של בעלי חיים. הכלים הביולוגיים והניסיוניים הזמינים במודלים אלה הוכיחו את עצמם כחיוניים לפיתוח הבנתנו את הבסיס המכניסטי של טרטוגניות אתנול, והתוצאות ממערכות מודל אלה תואמות להפליא את מה שנמצא במחקרי אתנול אנושיים 5,6. בין אלה, דגי זברה התפתחו כמודל רב עוצמה לחקר אתנול טרטוגנזה7,8, בין היתר בשל ההפריה החיצונית שלהם, פריון גבוה, יכולת משיכה גנטית ועוברים שקופים. עוצמות אלה משתלבות והופכות את דגי הזברה לאידיאליים למחקרי הדמיה חיים בזמן אמת של FASD באמצעות קווי דגי זברה טרנסגניים.
דגי זברה טרנסגניים שימשו באופן נרחב לחקר היבטים רבים של התפתחות עוברית9. עם זאת, יצירת מבנים טרנסגניים וקווים טרנסגניים הבאים יכולה להיות קשה מאוד. טרנסגן סטנדרטי דורש אלמנט מקדם פעיל כדי להניע את הטרנסגן ואות פולי A או “זנב”, כולם בווקטור חיידקי יציב לתחזוקה וקטורית כללית. הדור המסורתי של מבנה מהונדס מרובה רכיבים דורש שלבי שיבוט משנה מרובים הגוזלים זמן רב10. גישות מבוססות PCR, כגון הרכבת גיבסון, יכולות לעקוף חלק מהבעיות הקשורות לשיבוט משנה. עם זאת, פריימרים ייחודיים חייבים להיות מתוכננים ונבדקים עבור הדור של כל מבנה מהונדס ייחודי10. מעבר לבניית טרנסגנים, אינטגרציה גנומית, העברת תאי נבט וסינון לאינטגרציה טרנסגנית תקינה היו קשים גם כן. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לשימוש במערכת טרנסגנזה מבוססת טרנספוזון Tol2 (Tol2Kit)10,11. מערכת מודולרית זו משתמשת בשיבוט שער מרובה אתרים כדי ליצור במהירות מבנים טרנסגניים מרובים מספרייה הולכת ומתרחבת של וקטורי “כניסה” ו”יעד”. אלמנטים משולבים הניתנים לטרנספוזיה Tol2 מגבירים מאוד את קצב הטרנסגנזה, ומאפשרים בנייה מהירה ואינטגרציה גנומית של טרנסגנים מרובים. באמצעות מערכת זו, אנו מראים כיצד ניתן להשתמש ביצירת קו דגי זברה טרנסגניים של אנדודרם כדי לחקור את הפגמים המבניים הספציפיים לרקמות העומדים בבסיס FASD. בסופו של דבר, בפרוטוקול זה, אנו מראים כי ההתקנה המודולרית והבנייה של מבנים טרנסגניים יסייעו מאוד למחקר FASD מבוסס דגי זברה.
Protocol
Representative Results
Discussion
דגי זברה מתאימים באופן אידיאלי לחקר ההשפעה של חשיפה לאתנול על התפתחות ומצבי מחלות 7,8. דגי זברה מייצרים מספר רב של עוברים שקופים, מופרים חיצונית וניתנים למשיכה גנטית, מה שמאפשר הדמיה חיה של מספר רקמות וסוגי תאים המסומנים בטרנסגנים בו זמנית בהקשרים סביבתיים מ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר המוצג במאמר זה נתמך על ידי מענק מהמכונים הלאומיים לבריאות / המכון הלאומי לשימוש לרעה באלכוהול (NIH/NIAAA) R00AA023560 ל- C.B.L.
Materials
| Addgene Tol2 toolbox | https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/ | ||
| Air | Provided directly by the university | ||
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary | FHC | 30-30-0 | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Chloramphenicol | BioVision | 2486 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| Lawsone Lab Donor Plasmid Prep | https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/ | ||
| LB Agar | Fisher Scientific | BP9724 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| LR Clonase II Plus Enzyme | Fisher Scientific | 12538200 | |
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Micro Pipette holder | Applied Scientific Instrumentation | MIMPH-M-PIP | |
| Microcentrifuge tube 0.5 mL | VWR | 10025-724 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | VWR | 10025-716 | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Fisher Scientific | AM1340 | |
| Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet | https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1 | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | |
| NcoI | NEB | R0189S | |
| NotI | NEB | R0189S | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma Aldrich | P4758-5G | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Stericup .22 µm vacuum filtration system | Millipore | SCGPU11RE | |
| Tol2 Wiki Page | http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page | ||
| Top10 Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C404010 | |
| Vertical Pipetter Puller | David Kopf Instruments | 720 | |
| Zebrafish microinjection mold | Adaptive Science Tools | i34 |
References
- Denny, L., Coles, S., Blitz, R. Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders. American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).
- Popova, S., et al. Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis. The Lancet. 387 (10022), 978-987 (2016).
- Wilhoit, L. F., Scott, D. A., Simecka, B. A. Fetal alcohol spectrum disorders: Characteristics, complications, and treatment. Community Mental Health Journal. 53, 711-718 (2017).
- Wozniak, J. R., Riley, E. P., Charness, M. E. Clinical presentation, diagnosis, and management of fetal alcohol spectrum disorder. The Lancet Neurology. 18 (8), 760-770 (2019).
- Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A Comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
- Lovely, C. B. Animal models of gene-alcohol interactions. Birth Defects Research. 112 (4), 367-379 (2020).
- Fernandes, Y., Lovely, C. B. Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders. Genesis. 59 (11), 23460 (2021).
- Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
- Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab Animal Research. 37 (1), 26 (2021).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit forTol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Don, E. K., et al. A Tol2 gateway-compatible toolbox for the study of the nervous system and neurodegenerative disease. Zebrafish. 14 (1), 69-72 (2017).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Protocols. UMass Chan Medical School Available from: https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols (2017)
- Mosimann, C. Multisite gateway calculations: Excel spreadsheet. protocols.io. , (2022).
- Chung, W. -. S., Stainier, D. Y. R. Intra-endodermal interactions are required for pancreatic β cell induction. Developmental Cell. 14 (4), 582-593 (2008).
- Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (3), 325-332 (2010).
- Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish. Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).
- Silva Brito, R., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends. Science of The Total Environment. 848, 157665 (2022).
- Lai, K. P., Gong, Z., Tse, W. K. F. Zebrafish as the toxicant screening model: Transgenic and omics approaches. Aquatic Toxicology. 234, 105813 (2021).
- Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109 (3), 577-584 (1988).
- Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103 (2), 403-412 (1990).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system. Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).
