Выделение и культивирование макрофагов, полученных из костного мозга у мышей
Summary
В настоящем протоколе описывается выделение и культивирование макрофагов, полученных из костного мозга у мышей.
Abstract
Макрофаги выполняют важные эффекторные функции в гомеостазе и воспалении. Эти клетки присутствуют в каждой ткани организма и обладают важной способностью изменять свой профиль в соответствии со стимулами, присутствующими в микроокружении. Цитокины могут оказывать глубокое влияние на физиологию макрофагов, особенно ИФН-γ и интерлейкин 4, генерируя типы М1 и М2 соответственно. Из-за универсальности этих клеток производство популяции макрофагов, полученных из костного мозга, может быть основным шагом во многих экспериментальных моделях клеточной биологии. Цель этого протокола — помочь исследователям в выделении и культивировании макрофагов, полученных из предшественников костного мозга. Предшественники костного мозга от мышей C57BL/6, свободных от патогенов, превращаются в макрофаги при воздействии макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF), который в этом протоколе получают из надосадочной жидкости линии фибробластов мышей L-929. После инкубации зрелые макрофаги доступны для использования с7-го по10-й день. Одно животное может быть источником примерно 2 х10 7 макрофагов. Таким образом, он является идеальным протоколом для получения больших количеств первичных макрофагов с использованием основных методов культивирования клеток.
Introduction
Моноциты и макрофаги являются мононуклеарными фагоцитами, которые могут быть получены от предшественников в костном мозге. Недавние исследования показали, что макрофаги также происходят из эритро-миелоидных предшественников, полученных из желточного мешка1. Независимо от их происхождения, эти лейкоциты выполняют важные эффекторные функции в гомеостазе и воспалении 2,3. Моноциты — это клетки периферической крови, которые в дальнейшем могут дифференцироваться в макрофаги в ткани 2,4, тогда как макрофаги представляют собой гетерогенные клетки, которые демонстрируют фенотипы и функции, регулируемые местным воздействием факторов роста и цитокинов5. Поскольку макрофаги демонстрируют такое функциональное разнообразие, они были изучены на многих моделях заболеваний. Таким образом, культура макрофагов in vitro стала важным инструментом для понимания их физиологии и роли в различных заболеваниях. Костный мозг является важным источником клеток-предшественников, в том числе предшественников макрофагов, которые можно выделять и размножать, экспоненциально увеличивая количество получаемых макрофагов. Кроме того, макрофаги, полученные из костного мозга, особенно важны для того, чтобы избежать эффектов, генерируемых тканевым микроокружением, поскольку макрофаги изменяют свой фенотип в ответ на различные раздражители в тканях 6,7. Предшественники костного мозга превращаются в макрофаги при воздействии макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF)8. Макрофаги, полученные из костного мозга, невозможно отличить от макрофагов, полученных из моноцитов, по биохимическим маркерам в тканях. Эти клетки представляют собой высокооднородную популяцию первичных клеток, которые во многих других отношениях сопоставимы с перитонеальными макрофагами 6,9.
Из-за своего гетерогенного набора клеточных функций макрофаги уже давно тщательно изучены исследователями. Эти клетки могут быть использованы в различных экспериментальных моделях, в том числе при инфекционных и воспалительных заболеваниях, так как они участвуют в этих процессах10,11. Они также могут быть полезны для исследования поляризации макрофагов в ответ на различные микроэкологические стимулы12,13. Таким образом, здесь представлен простой и надежный протокол с целью получения большого количества первичных макрофагов из костного мозга мыши.
Protocol
Representative Results
Discussion
Получение популяции макрофагов, полученных из костного мозга, является основным шагом во многих экспериментальных моделях клеточной биологии, особенно когда важно достичь однородной популяции первичных клеток. Как уже упоминалось, клеточные предшественники могут превращаться в мак?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами от Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), через Rede de Pesquisa em Doenças Infecciosas Humanas e Animais do Estado de Minas Gerais (RED-00313-16) и Rede Mineira de Engenharia de Tecidos e Terapia Celular – REMETTEC (RED-00570-16), а также от Бразильского национального совета по научному и технологическому развитию (CNPq).
Materials
| 20-cc syringe | DESCARPACK | SI100S4G | Sterile syringe |
| 26-G needles | BD | 497AQDKT7 | Sterile needles |
| 50-ml conical centrifuge tube | SARSTEDT | 62547254 | Plastic conical tubes suitable for centrifugation |
| 70% ethanol solution | EMFAL | 490 | Ethanol solution for esterilization |
| Anatomical dissection forceps | 3B SCIENTIFIC | W1670 | Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution |
| C57Bl/6 wild type mouse | Purchased from Biotério Central at Federal University of Minas Gerais | Not applicable | Mice must be specific-pathogen-free, age between 6 and 10 weeks. Mice need be accommodated at least one week earlier for recovering from the stress of transportation |
| Cell culture flask T175 | GREINER | C7481-50EA | T-175 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free |
| Cell culture flask T75 | GREINER | C7231-120EA | T-75 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free |
| Disinfecting or baby Wipes₁ | CLOROX | Not applicable | It helps cleaning the bone |
| Distilled Water | GIBCO | 15230 | Sterile distilled water |
| DMEM/F12-10 | Not applicable | Not applicable | Add 10 mL of Fetal Bovine Serum (FBS) and 1 mL of Penicillin/ Streptomycin (P/S) to DMEM/F12 (q.s.p. 100 mL) |
| DMEM/F12-10 + supernatant of L-929 cells | Not applicable | Not applicable | Add 20% of supernatant of L929 cells culture on DMEM/F-12-10 |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium – F12 (DMEM/F12) | GIBCO | 12500096 | DMEM: F-12 Medium contains 2.5 mM L-glutamine, 15 mM HEPES, 0.5 mM sodium pyruvate, and 1200 mg/L sodium bicarbonate.Resuspend powder to 1 liter of distilled water and add 3,7 g of sodium bicarbonate. Adjust pH to 7,2 and filter with 0,22 µM. Storage at 2 – 8 °C freezer |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States (FBS) | GIBCO | 10082147 | Enrichment for DMEM-F12 |
| Hemocytometer | SIGMA-ALDRICH | Z359629 | Used to count macrophages at microscopy |
| L-929 cells | SIGMA-ALDRICH | ATCC # CCL-1 | L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF) |
| Nikon TI eclipse | NIKON | Not applicable | Nikon TI Eclipse is a fluorescence and phase contrast microscope |
| Non-enzymatic cell dissociation solution | CELLSTRIPER (CORNING) | 25-056-CI | Non-enzimatic cell dissociation solution remove macrophages from the plate without damaging them |
| Non-treated round culture dishes 100 × 20–mm | CORNING | CLS430591 | Do not use tissue culture treated petri dishes or any tissue culture treated plate |
| P3199 Penicillin G Potassium Salt | USBIOLOGICAL | 113-98-4 | Antibiotics |
| Penicillin and streptomycin (P/S) solution | Use 0,26 grams of penicillin and 0,40 grams of streptomycin. Mix with 40 mL of sterile PBS. Inside a horizontal laminar flow cabinet, use a 0,22 µM filter and store aliquots of 1.0 mL in 1.5 ml microfuge tubes in the freezer (-20°C) | ||
| Phosphate Buffered Saline free from Calcium and Magnesium (PBS) | MEDIATECH | 21-040-CM | Sterile |
| S7975 Streptomycin Sulfate, 650-850U/mg | USBIOLOGICAL | 3810-74-0 | Antibiotics |
| Serological pipettes of 10mL or 25 mL | SARSTEDT | 861254001 | Serological pipettes is used volumes higher than 1 mL |
| Sodium Bicarbonate | SIGMA-ALDRICH | 144-55-8 | pH correction for DMEM-F12 |
| Software Nis Elements Viewer | NIKON | Not applicable | NIS-Elements Viewer is a free standalone program to view image files and datasets |
| Sterile PBS and 2% of P/S solution | LABORCRIN | 590338 | Add 1 mL of P/S in 40 mL of sterile PBS |
| Straight iris scissors | KATENA | Not applicable | Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution |
| Supernatant of L-929 cells | Not applicable | Not applicable | L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF). L-929 supernatant was obtain from the protocol |
| Surgical Scalpel Blade No.24 Stainless Steel | SWANN-MORTON | 311 | Used for exposing epiphysis from bones |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | GIBCO | 15250061 | Trypan Blue Solution, 0.4%, is routinely used as a cell stain to assess cell viability using the dye exclusion test |
| Trypsin/EDTA solution 0,05% | GIBCO | 25300-062 | Used to dissociate cells from culture bottle |
| Water for Injection (WFI) for Cell Culture | GIBCO | A12873 | Sterile and endotoxin-free water |
References
- Gomez Perdiguero, E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- van Furth, R., Cohn, Z. A. The origin and kinetics of mononuclear phagocytes. The Journal of Experimental Medicine. 128 (3), 415-435 (1968).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454 (7203), 428-435 (2008).
- Shapouri-Moghaddam, A., et al. Macrophage plasticity, polarization, and function in health and disease. Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6425-6440 (2018).
- Davies, J. Q., Gordon, S. Isolation and culture of murine macrophages. Methods in Molecular Biology. 290, 91-103 (2005).
- Jin, X., Kruth, H. S. Culture of macrophage colony-stimulating factor differentiated human monocyte-derived macrophages. Journal of Visualized Experiments. (112), e54244 (2016).
- Gonçalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 1-16 (2015).
- Varol, C., Mildner, A., Jung, S. Macrophages: development and tissue specialization. Annual Review of Immunology. 33, 643-675 (2015).
- Andrés, V., Pello, O. M., Silvestre-Roig, C. Macrophage proliferation and apoptosis in atherosclerosis. Current Opinion in Lipidology. 23 (5), 429-438 (2012).
- Pineda-Torra, I., Gage, M., de Juan, A., Pello, O. M. Isolation, culture, and polarization of murine bone marrow-derived and peritoneal macrophages. Methods in Molecular Biology. 1339, 101-109 (2015).
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. Journal of Leukocyte Biology. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Hamczyk, M. R., Villa-Bellosta, R., Andrés, V. In vitro macrophage phagocytosis assay. Methods in Molecular Biology. 1339, 235-246 (2015).
- Hosoe, S., et al. Induction of tumoricidal macrophages from bone marrow cells of normal mice or mice bearing a colony-stimulating-factor-producing tumor. Cancer Immunology, Immunotherapy. 28 (2), 116-122 (1989).
- Rice, H. M., et al. rM-CSF efficiently replaces L929 in generating mouse and rat bone marrow-derived macrophages for in vitro functional studies of immunity to intracellular bacteria. Journal of Immunological Methods. 477, 112693 (2020).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant. Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone marrow-derived macrophages (BMM): isolation and applications. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (12), (2008).
- Austin, P. E., Mcculloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).
- Stanley, E. R. Macrophage colony-stimulating factor (CSF-1). Encyclopedia of Immunology. 116 (1983), 1650-1654 (1998).
- Bou Ghosn, E. E., et al. Two physically, functionally, and developmentally distinct peritoneal macrophage subsets. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (6), 2568-2573 (2010).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).
