Isolatie en cultuur van beenmerg-afgeleide macrofagen van muizen
Summary
Het huidige protocol beschrijft de isolatie en kweek van beenmerg-afgeleide macrofagen van muizen.
Abstract
Macrofagen hebben belangrijke effectorfuncties bij homeostase en ontsteking. Deze cellen zijn aanwezig in elk weefsel in het lichaam en hebben het belangrijke vermogen om hun profiel te veranderen afhankelijk van de stimuli die in de micro-omgeving aanwezig zijn. Cytokinen kunnen de fysiologie van macrofagen diepgaand beïnvloeden, met name IFN-γ en interleukine 4, en respectievelijk M1- en M2-typen genereren. Vanwege de veelzijdigheid van deze cellen kan de productie van een populatie van beenmerg-afgeleide macrofagen een basisstap zijn in veel experimentele modellen van celbiologie. Het doel van dit protocol is om onderzoekers te helpen bij het isoleren en kweken van macrofagen afkomstig van beenmergvoorlopercellen. Beenmergvoorlopercellen van pathogeenvrije C57BL/6-muizen worden omgezet in macrofagen bij blootstelling aan macrofaagkoloniestimulerende factor (M-CSF) die, in dit protocol, wordt verkregen uit het supernatans van de muizenfibroblastlijn L-929. Na incubatie zijn volwassen macrofagen beschikbaar voor gebruik van de 7etot de 10edag. Een enkel dier kan de bron zijn van ongeveer 2 x 107 macrofagen. Daarom is het een ideaal protocol voor het verkrijgen van grote hoeveelheden primaire macrofagen met behulp van basismethoden van celcultuur.
Introduction
Monocyten en macrofagen zijn mononucleaire fagocyten die kunnen worden afgeleid van voorlopercellen in het beenmerg. Recente studies hebben gemeld dat macrofagen ook afkomstig zijn van van dooierzak afgeleide erythro-myeloïde voorlopercellen1. Ongeacht hun afleiding hebben deze leukocyten belangrijke effectorfuncties bij homeostase en ontsteking 2,3. Monocyten zijn cellen uit perifeer bloed die verder kunnen differentiëren tot macrofagen in het weefsel 2,4, terwijl macrofagen heterogene cellen zijn die fenotypes en functies vertonen die worden gereguleerd door de lokale blootstelling van groeifactoren en cytokines5. Omdat macrofagen zo’n functionele diversiteit vertonen, zijn ze in veel ziektemodellen bestudeerd. De in vitro cultuur van macrofagen is dus een belangrijk hulpmiddel geworden om hun fysiologie en hun rol bij verschillende ziekten te begrijpen. Het beenmerg is een belangrijke bron van voorlopercellen, waaronder voorlopercellen van macrofagen, die kunnen worden geïsoleerd en vermenigvuldigd, waardoor het aantal verkregen macrofagen exponentieel toeneemt. Bovendien zijn van beenmerg afgeleide macrofagen vooral belangrijk om de effecten te voorkomen die worden gegenereerd door de micro-omgeving van het weefsel, aangezien macrofagen hun fenotype veranderen als reactie op verschillende stimuli in weefsels 6,7. Voorlopercellen van het beenmerg veranderen in macrofagen bij blootstelling aan macrofaagkoloniestimulerende factor (M-CSF)8. Van beenmerg afgeleide macrofagen kunnen niet worden onderscheiden van van monocyten afgeleide macrofagen door biochemische markers in weefsel. Deze cellen vertegenwoordigen een zeer homogene populatie van primaire cellen, die in veel andere opzichten vergelijkbaar zijn met peritoneale macrofagen 6,9.
Vanwege hun heterogene reeks cellulaire functies zijn macrofagen al lang grondig bestudeerd door onderzoekers. Deze cellen kunnen worden gebruikt in verschillende experimentele modellen, waaronder infectieziekten en ontstekingsziekten, omdat ze in deze processen voorkomen10,11. Ze kunnen ook nuttig zijn om de polarisatie van macrofagen te onderzoeken als reactie op verschillende micro-omgevingsstimuli12,13. Hier wordt dus een eenvoudig en betrouwbaar protocol geboden met als doel het verkrijgen van grote aantallen primaire macrofagen uit het beenmerg van muizen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het produceren van een populatie van beenmerg-afgeleide macrofagen is een basisstap in veel experimentele modellen in de celbiologie, vooral wanneer het belangrijk is om een homogene populatie van primaire cellen te bereiken. Zoals gezegd kunnen celvoorlopercellen alleen in macrofagen veranderen in aanwezigheid van M-CSF. L-929 celsupernatanten kunnen worden gebruikt als de belangrijkste bron van M-CSF. Afgezien van de kosten, is er geen probleem om recombinant M-CSF zelf 8,17<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), via Rede de Pesquisa em Doenças Infecciosas Humanas e Animais do Estado de Minas Gerais (RED-00313-16) en Rede Mineira de Engenharia de Tecidos e Terapia Celular – REMETTEC (RED-00570-16), en de Braziliaanse Nationale Raad voor Wetenschappelijke en Technologische Ontwikkeling (CNPq).
Materials
| 20-cc syringe | DESCARPACK | SI100S4G | Sterile syringe |
| 26-G needles | BD | 497AQDKT7 | Sterile needles |
| 50-ml conical centrifuge tube | SARSTEDT | 62547254 | Plastic conical tubes suitable for centrifugation |
| 70% ethanol solution | EMFAL | 490 | Ethanol solution for esterilization |
| Anatomical dissection forceps | 3B SCIENTIFIC | W1670 | Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution |
| C57Bl/6 wild type mouse | Purchased from Biotério Central at Federal University of Minas Gerais | Not applicable | Mice must be specific-pathogen-free, age between 6 and 10 weeks. Mice need be accommodated at least one week earlier for recovering from the stress of transportation |
| Cell culture flask T175 | GREINER | C7481-50EA | T-175 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free |
| Cell culture flask T75 | GREINER | C7231-120EA | T-75 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free |
| Disinfecting or baby Wipes₁ | CLOROX | Not applicable | It helps cleaning the bone |
| Distilled Water | GIBCO | 15230 | Sterile distilled water |
| DMEM/F12-10 | Not applicable | Not applicable | Add 10 mL of Fetal Bovine Serum (FBS) and 1 mL of Penicillin/ Streptomycin (P/S) to DMEM/F12 (q.s.p. 100 mL) |
| DMEM/F12-10 + supernatant of L-929 cells | Not applicable | Not applicable | Add 20% of supernatant of L929 cells culture on DMEM/F-12-10 |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium – F12 (DMEM/F12) | GIBCO | 12500096 | DMEM: F-12 Medium contains 2.5 mM L-glutamine, 15 mM HEPES, 0.5 mM sodium pyruvate, and 1200 mg/L sodium bicarbonate.Resuspend powder to 1 liter of distilled water and add 3,7 g of sodium bicarbonate. Adjust pH to 7,2 and filter with 0,22 µM. Storage at 2 – 8 °C freezer |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States (FBS) | GIBCO | 10082147 | Enrichment for DMEM-F12 |
| Hemocytometer | SIGMA-ALDRICH | Z359629 | Used to count macrophages at microscopy |
| L-929 cells | SIGMA-ALDRICH | ATCC # CCL-1 | L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF) |
| Nikon TI eclipse | NIKON | Not applicable | Nikon TI Eclipse is a fluorescence and phase contrast microscope |
| Non-enzymatic cell dissociation solution | CELLSTRIPER (CORNING) | 25-056-CI | Non-enzimatic cell dissociation solution remove macrophages from the plate without damaging them |
| Non-treated round culture dishes 100 × 20–mm | CORNING | CLS430591 | Do not use tissue culture treated petri dishes or any tissue culture treated plate |
| P3199 Penicillin G Potassium Salt | USBIOLOGICAL | 113-98-4 | Antibiotics |
| Penicillin and streptomycin (P/S) solution | Use 0,26 grams of penicillin and 0,40 grams of streptomycin. Mix with 40 mL of sterile PBS. Inside a horizontal laminar flow cabinet, use a 0,22 µM filter and store aliquots of 1.0 mL in 1.5 ml microfuge tubes in the freezer (-20°C) | ||
| Phosphate Buffered Saline free from Calcium and Magnesium (PBS) | MEDIATECH | 21-040-CM | Sterile |
| S7975 Streptomycin Sulfate, 650-850U/mg | USBIOLOGICAL | 3810-74-0 | Antibiotics |
| Serological pipettes of 10mL or 25 mL | SARSTEDT | 861254001 | Serological pipettes is used volumes higher than 1 mL |
| Sodium Bicarbonate | SIGMA-ALDRICH | 144-55-8 | pH correction for DMEM-F12 |
| Software Nis Elements Viewer | NIKON | Not applicable | NIS-Elements Viewer is a free standalone program to view image files and datasets |
| Sterile PBS and 2% of P/S solution | LABORCRIN | 590338 | Add 1 mL of P/S in 40 mL of sterile PBS |
| Straight iris scissors | KATENA | Not applicable | Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution |
| Supernatant of L-929 cells | Not applicable | Not applicable | L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF). L-929 supernatant was obtain from the protocol |
| Surgical Scalpel Blade No.24 Stainless Steel | SWANN-MORTON | 311 | Used for exposing epiphysis from bones |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | GIBCO | 15250061 | Trypan Blue Solution, 0.4%, is routinely used as a cell stain to assess cell viability using the dye exclusion test |
| Trypsin/EDTA solution 0,05% | GIBCO | 25300-062 | Used to dissociate cells from culture bottle |
| Water for Injection (WFI) for Cell Culture | GIBCO | A12873 | Sterile and endotoxin-free water |
References
- Gomez Perdiguero, E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- van Furth, R., Cohn, Z. A. The origin and kinetics of mononuclear phagocytes. The Journal of Experimental Medicine. 128 (3), 415-435 (1968).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454 (7203), 428-435 (2008).
- Shapouri-Moghaddam, A., et al. Macrophage plasticity, polarization, and function in health and disease. Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6425-6440 (2018).
- Davies, J. Q., Gordon, S. Isolation and culture of murine macrophages. Methods in Molecular Biology. 290, 91-103 (2005).
- Jin, X., Kruth, H. S. Culture of macrophage colony-stimulating factor differentiated human monocyte-derived macrophages. Journal of Visualized Experiments. (112), e54244 (2016).
- Gonçalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 1-16 (2015).
- Varol, C., Mildner, A., Jung, S. Macrophages: development and tissue specialization. Annual Review of Immunology. 33, 643-675 (2015).
- Andrés, V., Pello, O. M., Silvestre-Roig, C. Macrophage proliferation and apoptosis in atherosclerosis. Current Opinion in Lipidology. 23 (5), 429-438 (2012).
- Pineda-Torra, I., Gage, M., de Juan, A., Pello, O. M. Isolation, culture, and polarization of murine bone marrow-derived and peritoneal macrophages. Methods in Molecular Biology. 1339, 101-109 (2015).
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. Journal of Leukocyte Biology. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Hamczyk, M. R., Villa-Bellosta, R., Andrés, V. In vitro macrophage phagocytosis assay. Methods in Molecular Biology. 1339, 235-246 (2015).
- Hosoe, S., et al. Induction of tumoricidal macrophages from bone marrow cells of normal mice or mice bearing a colony-stimulating-factor-producing tumor. Cancer Immunology, Immunotherapy. 28 (2), 116-122 (1989).
- Rice, H. M., et al. rM-CSF efficiently replaces L929 in generating mouse and rat bone marrow-derived macrophages for in vitro functional studies of immunity to intracellular bacteria. Journal of Immunological Methods. 477, 112693 (2020).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant. Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone marrow-derived macrophages (BMM): isolation and applications. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (12), (2008).
- Austin, P. E., Mcculloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).
- Stanley, E. R. Macrophage colony-stimulating factor (CSF-1). Encyclopedia of Immunology. 116 (1983), 1650-1654 (1998).
- Bou Ghosn, E. E., et al. Two physically, functionally, and developmentally distinct peritoneal macrophage subsets. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (6), 2568-2573 (2010).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).
