Isolement et culture de macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris
Summary
Le présent protocole décrit l’isolement et la culture de macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris.
Abstract
Les macrophages ont d’importantes fonctions effectrices dans l’homéostasie et l’inflammation. Ces cellules sont présentes dans tous les tissus du corps et ont l’importante capacité de modifier leur profil en fonction des stimuli présents dans le microenvironnement. Les cytokines peuvent profondément affecter la physiologie des macrophages, en particulier l’IFN-γ et l’interleukine 4, générant respectivement les types M1 et M2. En raison de la polyvalence de ces cellules, la production d’une population de macrophages dérivés de la moelle osseuse peut être une étape fondamentale dans de nombreux modèles expérimentaux de biologie cellulaire. L’objectif de ce protocole est d’aider les chercheurs à isoler et à cultiver des macrophages dérivés de progéniteurs de la moelle osseuse. Les progéniteurs de la moelle osseuse de souris C57BL/6 exemptes d’agents pathogènes sont transformés en macrophages lors de l’exposition au facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF) qui, dans ce protocole, est obtenu à partir du surnageant de la lignée de fibroblastes murins L-929. Après l’incubation, les macrophages matures sont disponibles pour une utilisation du 7au 10e jour. Un seul animal peut être la source d’environ 2 x 107 macrophages. Par conséquent, il s’agit d’un protocole idéal pour obtenir de grandes quantités de macrophages primaires en utilisant des méthodes de base de culture cellulaire.
Introduction
Les monocytes et les macrophages sont des phagocytes mononucléaires qui peuvent être dérivés de progéniteurs dans la moelle osseuse. Des études récentes ont rapporté que les macrophages proviennent également de progéniteurs érythro-myéloïdes dérivés du sac vitellin1. Quelle que soit leur dérivation, ces leucocytes ont des fonctions effectrices importantes dans l’homéostasie et l’inflammation 2,3. Les monocytes sont des cellules du sang périphérique qui peuvent se différencier en macrophages dans les tissus 2,4, tandis que les macrophages sont des cellules hétérogènes qui présentent des phénotypes et des fonctions régulés par l’exposition locale de facteurs de croissance et de cytokines5. Étant donné que les macrophages présentent une telle diversité fonctionnelle, ils ont été étudiés dans de nombreux modèles de maladies. Ainsi, la culture in vitro des macrophages est devenue un outil important pour comprendre leur physiologie et leur rôle dans différentes maladies. La moelle osseuse est une source importante de cellules progénitrices, y compris les progéniteurs de macrophages, qui peuvent être isolés et multipliés, augmentant ainsi de façon exponentielle le nombre de macrophages obtenus. De plus, les macrophages dérivés de la moelle osseuse sont particulièrement importants pour éviter les effets générés par le microenvironnement tissulaire, car les macrophages changent de phénotype en réponse à différents stimuli dans les tissus 6,7. Les progéniteurs de la moelle osseuse se transforment en macrophages lorsqu’ils sont exposés au facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF)8. Les macrophages dérivés de la moelle osseuse ne peuvent pas être distingués des macrophages dérivés des monocytes par des marqueurs biochimiques dans les tissus. Ces cellules représentent une population très homogène de cellules primaires, qui, à bien d’autres égards, sont comparables aux macrophages péritonéaux 6,9.
En raison de leur ensemble hétérogène de fonctions cellulaires, les macrophages ont longtemps été étudiés en profondeur par les chercheurs. Ces cellules peuvent être utilisées dans différents modèles expérimentaux, y compris les maladies infectieuses et inflammatoires, car elles sont présentes dans ces processus10,11. Ils peuvent également être utiles pour étudier la polarisation des macrophages en réponse à divers stimuli microenvironnementaux12,13. Ainsi, un protocole simple et fiable est fourni ici dans le but d’obtenir un grand nombre de macrophages primaires à partir de la moelle osseuse de souris.
Protocol
Representative Results
Discussion
La production d’une population de macrophages dérivés de la moelle osseuse est une étape fondamentale dans de nombreux modèles expérimentaux de biologie cellulaire, en particulier lorsqu’il est important d’obtenir une population homogène de cellules primaires. Comme nous l’avons mentionné, les progéniteurs cellulaires ne peuvent se transformer en macrophages qu’en présence de M-CSF. Les surnageants cellulaires L-929 peuvent être utilisés comme source principale de M-CSF. Outre le coût, il n’y a au…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), par l’intermédiaire de Rede de Pesquisa em Doenças Infecciosas Humanas e Animais do Estado de Minas Gerais (RED-00313-16) et de Rede Mineira de Engenharia de Tecidos e Terapia Celular – REMETTEC (RED-00570-16), et du Conseil national brésilien pour le développement scientifique et technologique (CNPq).
Materials
| 20-cc syringe | DESCARPACK | SI100S4G | Sterile syringe |
| 26-G needles | BD | 497AQDKT7 | Sterile needles |
| 50-ml conical centrifuge tube | SARSTEDT | 62547254 | Plastic conical tubes suitable for centrifugation |
| 70% ethanol solution | EMFAL | 490 | Ethanol solution for esterilization |
| Anatomical dissection forceps | 3B SCIENTIFIC | W1670 | Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution |
| C57Bl/6 wild type mouse | Purchased from Biotério Central at Federal University of Minas Gerais | Not applicable | Mice must be specific-pathogen-free, age between 6 and 10 weeks. Mice need be accommodated at least one week earlier for recovering from the stress of transportation |
| Cell culture flask T175 | GREINER | C7481-50EA | T-175 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free |
| Cell culture flask T75 | GREINER | C7231-120EA | T-75 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free |
| Disinfecting or baby Wipes₁ | CLOROX | Not applicable | It helps cleaning the bone |
| Distilled Water | GIBCO | 15230 | Sterile distilled water |
| DMEM/F12-10 | Not applicable | Not applicable | Add 10 mL of Fetal Bovine Serum (FBS) and 1 mL of Penicillin/ Streptomycin (P/S) to DMEM/F12 (q.s.p. 100 mL) |
| DMEM/F12-10 + supernatant of L-929 cells | Not applicable | Not applicable | Add 20% of supernatant of L929 cells culture on DMEM/F-12-10 |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium – F12 (DMEM/F12) | GIBCO | 12500096 | DMEM: F-12 Medium contains 2.5 mM L-glutamine, 15 mM HEPES, 0.5 mM sodium pyruvate, and 1200 mg/L sodium bicarbonate.Resuspend powder to 1 liter of distilled water and add 3,7 g of sodium bicarbonate. Adjust pH to 7,2 and filter with 0,22 µM. Storage at 2 – 8 °C freezer |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States (FBS) | GIBCO | 10082147 | Enrichment for DMEM-F12 |
| Hemocytometer | SIGMA-ALDRICH | Z359629 | Used to count macrophages at microscopy |
| L-929 cells | SIGMA-ALDRICH | ATCC # CCL-1 | L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF) |
| Nikon TI eclipse | NIKON | Not applicable | Nikon TI Eclipse is a fluorescence and phase contrast microscope |
| Non-enzymatic cell dissociation solution | CELLSTRIPER (CORNING) | 25-056-CI | Non-enzimatic cell dissociation solution remove macrophages from the plate without damaging them |
| Non-treated round culture dishes 100 × 20–mm | CORNING | CLS430591 | Do not use tissue culture treated petri dishes or any tissue culture treated plate |
| P3199 Penicillin G Potassium Salt | USBIOLOGICAL | 113-98-4 | Antibiotics |
| Penicillin and streptomycin (P/S) solution | Use 0,26 grams of penicillin and 0,40 grams of streptomycin. Mix with 40 mL of sterile PBS. Inside a horizontal laminar flow cabinet, use a 0,22 µM filter and store aliquots of 1.0 mL in 1.5 ml microfuge tubes in the freezer (-20°C) | ||
| Phosphate Buffered Saline free from Calcium and Magnesium (PBS) | MEDIATECH | 21-040-CM | Sterile |
| S7975 Streptomycin Sulfate, 650-850U/mg | USBIOLOGICAL | 3810-74-0 | Antibiotics |
| Serological pipettes of 10mL or 25 mL | SARSTEDT | 861254001 | Serological pipettes is used volumes higher than 1 mL |
| Sodium Bicarbonate | SIGMA-ALDRICH | 144-55-8 | pH correction for DMEM-F12 |
| Software Nis Elements Viewer | NIKON | Not applicable | NIS-Elements Viewer is a free standalone program to view image files and datasets |
| Sterile PBS and 2% of P/S solution | LABORCRIN | 590338 | Add 1 mL of P/S in 40 mL of sterile PBS |
| Straight iris scissors | KATENA | Not applicable | Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution |
| Supernatant of L-929 cells | Not applicable | Not applicable | L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF). L-929 supernatant was obtain from the protocol |
| Surgical Scalpel Blade No.24 Stainless Steel | SWANN-MORTON | 311 | Used for exposing epiphysis from bones |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | GIBCO | 15250061 | Trypan Blue Solution, 0.4%, is routinely used as a cell stain to assess cell viability using the dye exclusion test |
| Trypsin/EDTA solution 0,05% | GIBCO | 25300-062 | Used to dissociate cells from culture bottle |
| Water for Injection (WFI) for Cell Culture | GIBCO | A12873 | Sterile and endotoxin-free water |
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