Aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea a partir de ratones
Summary
El presente protocolo describe el aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea de ratones.
Abstract
Los macrófagos tienen importantes funciones efectoras en la homeostasis y la inflamación. Estas células están presentes en todos los tejidos del cuerpo y tienen la importante capacidad de cambiar su perfil de acuerdo con los estímulos presentes en el microambiente. Las citocinas pueden afectar profundamente a la fisiología de los macrófagos, especialmente al IFN-γ y a la interleucina 4, generando tipos M1 y M2 respectivamente. Debido a la versatilidad de estas células, la producción de una población de macrófagos derivados de la médula ósea puede ser un paso básico en muchos modelos experimentales de biología celular. El objetivo de este protocolo es ayudar a los investigadores en el aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de progenitores de médula ósea. Los progenitores de médula ósea de ratones C57BL/6 libres de patógenos se transforman en macrófagos tras la exposición al factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) que, en este protocolo, se obtiene del sobrenadante del linaje de fibroblastos murinos L-929. Después de la incubación, los macrófagos maduros están disponibles para su uso del7º al 10º día. Un solo animal puede ser la fuente de aproximadamente 2 x 107 macrófagos. Por lo tanto, es un protocolo ideal para la obtención de grandes cantidades de macrófagos primarios utilizando métodos básicos de cultivo celular.
Introduction
Los monocitos y macrófagos son fagocitos mononucleares que pueden derivarse de progenitores en la médula ósea. Estudios recientes han reportado que los macrófagos también se originan a partir de progenitores eritromieloides derivados del saco vitelino1. Independientemente de su derivación, estos leucocitos tienen importantes funciones efectoras en la homeostasis y la inflamación 2,3. Los monocitos son células de sangre periférica que pueden diferenciarse en macrófagos en el tejido 2,4, mientras que los macrófagos son células heterogéneas que exhiben fenotipos y funciones reguladas por la exposición local a factores de crecimiento y citocinas5. Dado que los macrófagos muestran tal diversidad funcional, se han estudiado en muchos modelos de enfermedades. Así, el cultivo in vitro de macrófagos se ha convertido en una herramienta importante para comprender su fisiología y su papel en diferentes enfermedades. La médula ósea es una fuente importante de células progenitoras, incluidos los progenitores de macrófagos, que pueden aislarse y multiplicarse, aumentando exponencialmente el número de macrófagos obtenidos. Además, los macrófagos derivados de la médula ósea son especialmente importantes para evitar los efectos generados por el microambiente tisular, ya que los macrófagos cambian su fenotipo en respuesta a diferentes estímulos en los tejidos 6,7. Los progenitores de la médula ósea se transforman en macrófagos tras la exposición al factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF)8. Los macrófagos derivados de la médula ósea no se pueden distinguir de los macrófagos derivados de monocitos mediante marcadores bioquímicos en los tejidos. Estas células representan una población muy homogénea de células primarias, que en muchos otros aspectos son comparables a los macrófagos peritoneales 6,9.
Debido a su conjunto heterogéneo de funciones celulares, los macrófagos han sido estudiados minuciosamente por los investigadores. Estas células pueden ser utilizadas en diferentes modelos experimentales, incluyendo enfermedades infecciosas e inflamatorias, ya que están presentes en estos procesos10,11. También pueden ser útiles para investigar la polarización de los macrófagos en respuesta a diversos estímulos microambientales12,13. Por lo tanto, aquí se proporciona un protocolo simple y confiable con el fin de obtener un alto número de macrófagos primarios de la médula ósea del ratón.
Protocol
Representative Results
Discussion
La producción de una población de macrófagos derivados de la médula ósea es un paso básico en muchos modelos experimentales de biología celular, especialmente cuando es importante lograr una población homogénea de células primarias. Como se mencionó, los progenitores celulares solo pueden transformarse en macrófagos en presencia de M-CSF. Los sobrenadantes celulares L-929 se pueden utilizar como fuente principal de M-CSF. Aparte del costo, no hay problema con el uso de M-CSF recombinante en sí mismo<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo contó con el apoyo de la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), a través de la Red de Pesquisa em Doenças Infecciosas Humanas e Animais do Estado de Minas Gerais (RED-00313-16) y la Red Minera de Engenharia de Tecidos e Terapia Celular – REMETTEC (RED-00570-16), y el Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq) de Brasil.
Materials
| 20-cc syringe | DESCARPACK | SI100S4G | Sterile syringe |
| 26-G needles | BD | 497AQDKT7 | Sterile needles |
| 50-ml conical centrifuge tube | SARSTEDT | 62547254 | Plastic conical tubes suitable for centrifugation |
| 70% ethanol solution | EMFAL | 490 | Ethanol solution for esterilization |
| Anatomical dissection forceps | 3B SCIENTIFIC | W1670 | Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution |
| C57Bl/6 wild type mouse | Purchased from Biotério Central at Federal University of Minas Gerais | Not applicable | Mice must be specific-pathogen-free, age between 6 and 10 weeks. Mice need be accommodated at least one week earlier for recovering from the stress of transportation |
| Cell culture flask T175 | GREINER | C7481-50EA | T-175 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free |
| Cell culture flask T75 | GREINER | C7231-120EA | T-75 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free |
| Disinfecting or baby Wipes₁ | CLOROX | Not applicable | It helps cleaning the bone |
| Distilled Water | GIBCO | 15230 | Sterile distilled water |
| DMEM/F12-10 | Not applicable | Not applicable | Add 10 mL of Fetal Bovine Serum (FBS) and 1 mL of Penicillin/ Streptomycin (P/S) to DMEM/F12 (q.s.p. 100 mL) |
| DMEM/F12-10 + supernatant of L-929 cells | Not applicable | Not applicable | Add 20% of supernatant of L929 cells culture on DMEM/F-12-10 |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium – F12 (DMEM/F12) | GIBCO | 12500096 | DMEM: F-12 Medium contains 2.5 mM L-glutamine, 15 mM HEPES, 0.5 mM sodium pyruvate, and 1200 mg/L sodium bicarbonate.Resuspend powder to 1 liter of distilled water and add 3,7 g of sodium bicarbonate. Adjust pH to 7,2 and filter with 0,22 µM. Storage at 2 – 8 °C freezer |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States (FBS) | GIBCO | 10082147 | Enrichment for DMEM-F12 |
| Hemocytometer | SIGMA-ALDRICH | Z359629 | Used to count macrophages at microscopy |
| L-929 cells | SIGMA-ALDRICH | ATCC # CCL-1 | L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF) |
| Nikon TI eclipse | NIKON | Not applicable | Nikon TI Eclipse is a fluorescence and phase contrast microscope |
| Non-enzymatic cell dissociation solution | CELLSTRIPER (CORNING) | 25-056-CI | Non-enzimatic cell dissociation solution remove macrophages from the plate without damaging them |
| Non-treated round culture dishes 100 × 20–mm | CORNING | CLS430591 | Do not use tissue culture treated petri dishes or any tissue culture treated plate |
| P3199 Penicillin G Potassium Salt | USBIOLOGICAL | 113-98-4 | Antibiotics |
| Penicillin and streptomycin (P/S) solution | Use 0,26 grams of penicillin and 0,40 grams of streptomycin. Mix with 40 mL of sterile PBS. Inside a horizontal laminar flow cabinet, use a 0,22 µM filter and store aliquots of 1.0 mL in 1.5 ml microfuge tubes in the freezer (-20°C) | ||
| Phosphate Buffered Saline free from Calcium and Magnesium (PBS) | MEDIATECH | 21-040-CM | Sterile |
| S7975 Streptomycin Sulfate, 650-850U/mg | USBIOLOGICAL | 3810-74-0 | Antibiotics |
| Serological pipettes of 10mL or 25 mL | SARSTEDT | 861254001 | Serological pipettes is used volumes higher than 1 mL |
| Sodium Bicarbonate | SIGMA-ALDRICH | 144-55-8 | pH correction for DMEM-F12 |
| Software Nis Elements Viewer | NIKON | Not applicable | NIS-Elements Viewer is a free standalone program to view image files and datasets |
| Sterile PBS and 2% of P/S solution | LABORCRIN | 590338 | Add 1 mL of P/S in 40 mL of sterile PBS |
| Straight iris scissors | KATENA | Not applicable | Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution |
| Supernatant of L-929 cells | Not applicable | Not applicable | L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF). L-929 supernatant was obtain from the protocol |
| Surgical Scalpel Blade No.24 Stainless Steel | SWANN-MORTON | 311 | Used for exposing epiphysis from bones |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | GIBCO | 15250061 | Trypan Blue Solution, 0.4%, is routinely used as a cell stain to assess cell viability using the dye exclusion test |
| Trypsin/EDTA solution 0,05% | GIBCO | 25300-062 | Used to dissociate cells from culture bottle |
| Water for Injection (WFI) for Cell Culture | GIBCO | A12873 | Sterile and endotoxin-free water |
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