マウス由来骨髄由来マクロファージの単離と培養
Summary
本プロトコールは、マウスからの骨髄由来マクロファージの単離および培養について記載している。
Abstract
マクロファージは、ホメオスタシスと炎症において重要なエフェクター機能を持っています。これらの細胞は、体内のあらゆる組織に存在し、微小環境に存在する刺激に応じてプロファイルを変化させる重要な能力を持っています。サイトカインはマクロファージの生理機能、特にIFN-γとインターロイキン4に深く影響し、それぞれM1型とM2型を生成します。これらの細胞の多様性により、骨髄由来マクロファージの集団の産生は、細胞生物学の多くの実験モデルにおける基本的なステップとなり得ます。このプロトコルの目的は、骨髄前駆細胞に由来するマクロファージの単離と培養において研究者を支援することです。病原体を含まないC57BL/6マウスの骨髄前駆細胞は、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)への曝露によりマクロファージに変換されます。これは、このプロトコルでは、マウス線維芽細胞系統L-929の上清から得られます。インキュベーション後、成熟したマクロファージは7日目 から10日目まで 使用できます。1匹の動物が約2 x 107 マクロファージの供給源になることがあります。したがって、これは、細胞培養の基本的な方法を使用して大量の初代マクロファージを得るための理想的なプロトコルです。
Introduction
単球とマクロファージは、骨髄の前駆細胞に由来する単核食細胞です。近年の研究で、マクロファージは卵黄嚢由来の赤骨髄系前駆細胞にも由来することが報告されています1。その由来に関係なく、これらの白血球は恒常性や炎症において重要なエフェクター機能を持っています2,3。単球は末梢血由来の細胞であり、組織内でさらにマクロファージに分化することができる2,4のに対し、マクロファージは、成長因子やサイトカインの局所的な曝露によって制御される表現型や機能を示す不均一な細胞である5。マクロファージはこのような機能的多様性を示すため、多くの疾患モデルで研究されてきました。したがって、マクロファージのin vitro培養は、マクロファージの生理機能とさまざまな疾患におけるマクロファージの役割を理解するための重要なツールになっています。骨髄は、マクロファージ前駆細胞を含む前駆細胞の重要な供給源であり、これを単離して増殖させることで、得られるマクロファージの数を指数関数的に増加させることができます。さらに、骨髄由来のマクロファージは、組織内の異なる刺激に応答して表現型を変化させるため、組織微小環境によって生じる影響を回避するために特に重要である6,7。骨髄前駆細胞は、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)8に曝露されるとマクロファージに変化します。骨髄由来マクロファージは、組織中の生化学的マーカーによって単球由来マクロファージと区別することはできません。これらの細胞は、初代細胞の非常に均質な集団を表しており、他の多くの点で腹膜マクロファージに匹敵します6,9。
マクロファージは細胞機能が不均一であるため、研究者によって長い間徹底的に研究されてきました。これらの細胞は、これらのプロセスに特徴があるため、感染性疾患や炎症性疾患を含むさまざまな実験モデルで使用できます10,11。それらはまた、種々の微小環境刺激に応答したマクロファージの分極を調べるのにも有用であり得る12,13。したがって、ここでは、マウスの骨髄から多数の一次マクロファージを得る目的で、単純で信頼性の高いプロトコルが提供されています。
Protocol
この議定書は、全米動物実験管理評議会(Concea)および動物倫理および使用委員会(CEUA)の承認を得て実施されました。C57BL/6マウスは、ブラジルのベロオリゾンテにあるミナスジェライス連邦大学(UFMG)のBiotério Centralから購入しました。このプロトコルに記載されているすべてのステップで、白衣、手袋、目の保護具などの個人用保護具(PPE)を使用する必要があります。 1…
Representative Results
マクロファージは、特殊な生理学的特性を持つ大きくて付着性の細胞です。それらは、ガラスやプラスチックに接着する能力のために、培養における多様な形態学的提示を示し、それらの典型的な広がりの形態は細胞質伸長の放出に関連しています(図1)。骨髄前駆細胞がL-929細胞上清からM-CSFに曝露され、成熟マクロファージへの形質転換を開始すると、ペトリプレート…
Discussion
骨髄由来マクロファージの集団を作製することは、多くの細胞生物学実験モデルにおける基本的なステップであり、特に初代細胞の均一な集団を達成することが重要な場合です。前述のように、細胞前駆細胞はM-CSFの存在下でのみマクロファージに形質転換できます。L-929細胞上清は、M-CSFの主な供給源として使用できます。コスト以外は、組換えM-CSF自体8,17<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG)、Rede de Pesquisa em Doenças Infecciosas Humanas e Animais do Estado de Minas Gerais (RED-00313-16)、Rede Mineira de Engenharia de Tecidos e Terapia Celular – REMETTEC (RED-00570-16)、ブラジル国立科学技術開発評議会 (CNPq) からの助成金によって支援されました。
Materials
| 20-cc syringe | DESCARPACK | SI100S4G | Sterile syringe |
| 26-G needles | BD | 497AQDKT7 | Sterile needles |
| 50-ml conical centrifuge tube | SARSTEDT | 62547254 | Plastic conical tubes suitable for centrifugation |
| 70% ethanol solution | EMFAL | 490 | Ethanol solution for esterilization |
| Anatomical dissection forceps | 3B SCIENTIFIC | W1670 | Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution |
| C57Bl/6 wild type mouse | Purchased from Biotério Central at Federal University of Minas Gerais | Not applicable | Mice must be specific-pathogen-free, age between 6 and 10 weeks. Mice need be accommodated at least one week earlier for recovering from the stress of transportation |
| Cell culture flask T175 | GREINER | C7481-50EA | T-175 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free |
| Cell culture flask T75 | GREINER | C7231-120EA | T-75 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free |
| Disinfecting or baby Wipes₁ | CLOROX | Not applicable | It helps cleaning the bone |
| Distilled Water | GIBCO | 15230 | Sterile distilled water |
| DMEM/F12-10 | Not applicable | Not applicable | Add 10 mL of Fetal Bovine Serum (FBS) and 1 mL of Penicillin/ Streptomycin (P/S) to DMEM/F12 (q.s.p. 100 mL) |
| DMEM/F12-10 + supernatant of L-929 cells | Not applicable | Not applicable | Add 20% of supernatant of L929 cells culture on DMEM/F-12-10 |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium – F12 (DMEM/F12) | GIBCO | 12500096 | DMEM: F-12 Medium contains 2.5 mM L-glutamine, 15 mM HEPES, 0.5 mM sodium pyruvate, and 1200 mg/L sodium bicarbonate.Resuspend powder to 1 liter of distilled water and add 3,7 g of sodium bicarbonate. Adjust pH to 7,2 and filter with 0,22 µM. Storage at 2 – 8 °C freezer |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States (FBS) | GIBCO | 10082147 | Enrichment for DMEM-F12 |
| Hemocytometer | SIGMA-ALDRICH | Z359629 | Used to count macrophages at microscopy |
| L-929 cells | SIGMA-ALDRICH | ATCC # CCL-1 | L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF) |
| Nikon TI eclipse | NIKON | Not applicable | Nikon TI Eclipse is a fluorescence and phase contrast microscope |
| Non-enzymatic cell dissociation solution | CELLSTRIPER (CORNING) | 25-056-CI | Non-enzimatic cell dissociation solution remove macrophages from the plate without damaging them |
| Non-treated round culture dishes 100 × 20–mm | CORNING | CLS430591 | Do not use tissue culture treated petri dishes or any tissue culture treated plate |
| P3199 Penicillin G Potassium Salt | USBIOLOGICAL | 113-98-4 | Antibiotics |
| Penicillin and streptomycin (P/S) solution | Use 0,26 grams of penicillin and 0,40 grams of streptomycin. Mix with 40 mL of sterile PBS. Inside a horizontal laminar flow cabinet, use a 0,22 µM filter and store aliquots of 1.0 mL in 1.5 ml microfuge tubes in the freezer (-20°C) | ||
| Phosphate Buffered Saline free from Calcium and Magnesium (PBS) | MEDIATECH | 21-040-CM | Sterile |
| S7975 Streptomycin Sulfate, 650-850U/mg | USBIOLOGICAL | 3810-74-0 | Antibiotics |
| Serological pipettes of 10mL or 25 mL | SARSTEDT | 861254001 | Serological pipettes is used volumes higher than 1 mL |
| Sodium Bicarbonate | SIGMA-ALDRICH | 144-55-8 | pH correction for DMEM-F12 |
| Software Nis Elements Viewer | NIKON | Not applicable | NIS-Elements Viewer is a free standalone program to view image files and datasets |
| Sterile PBS and 2% of P/S solution | LABORCRIN | 590338 | Add 1 mL of P/S in 40 mL of sterile PBS |
| Straight iris scissors | KATENA | Not applicable | Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution |
| Supernatant of L-929 cells | Not applicable | Not applicable | L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF). L-929 supernatant was obtain from the protocol |
| Surgical Scalpel Blade No.24 Stainless Steel | SWANN-MORTON | 311 | Used for exposing epiphysis from bones |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | GIBCO | 15250061 | Trypan Blue Solution, 0.4%, is routinely used as a cell stain to assess cell viability using the dye exclusion test |
| Trypsin/EDTA solution 0,05% | GIBCO | 25300-062 | Used to dissociate cells from culture bottle |
| Water for Injection (WFI) for Cell Culture | GIBCO | A12873 | Sterile and endotoxin-free water |
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Cite This Article
Gonçalves, R., Kaliff Teófilo Murta, G., Aparecida de Souza, I., Mosser, D. M. Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice. J. Vis. Exp. (196), e64566, doi:10.3791/64566 (2023).